关键词： 输血依赖性地中海贫血   造血干细胞移植   混合嵌合   供者淋巴细胞输注   移植物抗宿主病  

摘要： 目的通过总结12例输血依赖性地中海贫血移植后行供者淋巴细胞输注(donor lymphocyte infusion,DLI)患者的情况,探讨DLI在移植后发生混合嵌合(mixed chimerism,MC)患者中的作用及安全性。资料和方法收集我院儿科三病区2018年05月至2021年02月诊治的12例输血依赖性地中海贫血移植后发生MC患者的临床资料,包括预处理方案、预防移植物抗宿主病方案(graft-versus-host-disease,GVHD)、供者嵌合率(donor chimerism,DC)检测方式、DLI策略等。并分析总结DLI后患者DC率的变化、及其相关并发症。结果1.本研究共纳入12例病例,包括10例男性患者、2例女性患者,中位年龄5岁6月(2岁10月-13岁5月)。10例患者为同胞全相合造血干细胞移植、2例患者为半相合造血干细胞移植。12例患者移植后均成功获得造血重建,首次DC率检测11例患者获得完全嵌合(complete chimerism,CC)、1例患者获得MC 1级。所有患者在移植后至DLI前的阶段中均没有发生严重GVHD。2.在随访中发现该12例患者DC率呈持续下降趋势,DC率开始下降的中位时间为63天(43天-128天),且经停用免疫抑制剂后DC率无改善。在初次DLI前检测DC率提示8例患者为MC 2级、4例患者为MC 3级。12例患者共经历14次DLI治疗,包括10例患者各行1次DLI、2例患者分别行2次DLI。经输注后,患者DC率逐渐上升,最终10例患者获得CC。此外有2例患者表现为MC,1例为持续性MC 1级、1例为持续性MC 2级,但未出现返回输血状态、亦无GVHD发生。3.12例患者移植后监测DC率过程中发现患者DC率下降至最低点时(67.83%-87%),但同期RBC、Hb并未出现明显下降。4.12例患者经14次DLI后5例患者发生急性GVHD,3例表现为Ⅰ-Ⅱ度急性GVHD、2例表现为Ⅲ-Ⅳ度急性GVHD。其中Ⅰ-Ⅱ度急性GVHD均发生在全相合造血干细胞移植患者,Ⅲ-Ⅳ度急性GVHD均发生在半相合造血干细胞移植患者。5.经DLI治疗后4例患者出现短期造血功能异常,2例发生在全相合造血干细胞移植、2例发生在半相合造血干细胞移植。2例全相合移植患者表现较轻,经予严密观察后自行恢复至正常造血状态。2例半相合移植患者血常规表现为三系降低、且持续时间较全相合患者时间长,需输注红细胞、血小板等成分血液、以及相关支持治疗。6.中位随访时间为588天(203天至997天),12例患者中9例患者为CC、1例为MC 1级、1例为MC 2级。另1例患者因并发中枢神经系统巨细胞病毒感染死亡。结论1.本次研究的12例地中海贫血患者移植后发生MC的中位时间是63天,在此之前后密切监测DC率的变化很有必要。***是阻止DC率下降、并促使其回升的有效措施。***是DLI的主要并发症,其中同胞全相合移植患者行DLI时发生GVHD的严重等级明显低于半相合移植患者。4.半相合移植患者行DLI时需要慎重决定,DLI后可采用预防GVHD的措施、及密切监测病情。5.地中海贫血患者MC的发生与疾病复发并不平行,DC率的下降早于血液学变化。

关键词： 磁共振成像   脾切除术   β地中海贫血   铁超载  

摘要： 目的:利用磁共振R2*参数探究脾脏切除手术对重型β地中海贫血病人心肌和肝脏铁代谢的影响。方法:1.检查方法所有病人均行心脏及腹部3.0T SIEMRNS MRI多回波梯度扫描。在***工作站对图像进行后处理ROI区间分析及CMRtools联合EXCEL表格拟合曲线,测定肝脏及心脏的T2*参数值,计算R2*值。2.病例收集第一组收集2017年1月-2020年12月我院行心脏及肝脏磁共振铁沉积定量检查的地中海贫血病人共442例,按检查前是否进行脾切手术分为脾切组及非脾切组,分别为脾切组116例和非脾切组326例;第二组按照年龄、性别、输血量及祛铁情况进行脾切组及非脾切组各58例的TM病人配对。3.统计学分析应用完全随机设计两样本的秩和检验比较第一组脾切与非脾切组肝脏及心脏R2*的差异,应用配对t检验比较第二组脾切组与非脾切组心肌、肝脏R2*值。应用卡方检验比较第一、二组脾切与非脾切组心肌和肝脏铁沉积正常以及重度铁沉积占比。结果:1.第一组所有完成MRI心肌及肝脏铁定量检查的地中海贫血病人442例,其中包括60例复查病例,脾切组116例,非脾切组326例,其中76例可查询获知确切的脾脏切除手术时间,另40例未知,脾切组中含TM病例89例,非脾切组中含TM病例208例,两组病例中,358例显示心肌铁沉积正常,随机设计两样本秩和检验比较脾切与非脾切重型β型地中海贫血病人的内脏铁沉积:脾切组肝脏R2*值均高于非脾切组,差异有统计学意义,脾气切组与非脾切组心肌R2*值无统计学差异,经四格表卡方检验,两组铁沉积正常占比无统计差异,非脾切组心肌铁沉积和肝脏铁沉积测量所得到的重度铁沉积占比均小于脾切组得重度铁沉积占比。2.第二组58对脾切与非脾切配对组均于3.0T SIEMRNS MRI行上腹部及心肌多回波GRE序列扫描,其中脾切组所有病例在脾切后平均第42个月进行了该项MRI心肌及肝脏铁含量梯度回波扫描,且两组最大年龄差距均不超过6个月,两组各有49例行规律输血治疗,且均有37例近一年内行规律祛铁及铁螯合治疗,经过统计学的比较分析,两组病例在年龄、性别、心肌R2*值相互比较差异均无统计学意义,脾切组肝脏R2*值高于非脾切组,脾切组肝脏重度铁沉积占比高于非脾切组。结论:(1)大部分重型β型地中海贫血病人心肌铁浓度值正常,少部分肝脏铁浓度值正常;(2)脾切除术增高了地中海贫血病人肝脏和心肌重度铁沉积的占比;(3)脾脏作为储铁器官和维持肝脏铁代谢水平稳定的缓冲区,脾切除术加重了重型β地中海贫血病人的肝脏铁沉积。

关键词： 无创产前检测   β地中海贫血   产前诊断   meta分析  

摘要： 研究背景:β地中海贫血(beta-thalassemia)是世界上最常见的常染色体单基因遗传病之一,β地中海贫血患儿的疾病分型为中重型时,患儿在出生后3-6月可能出现溶血性贫血症状,随着年龄增大会逐渐加重,缺乏特异性治疗手段,患儿需要依赖长期定期或不定期输血和祛铁治疗存活,根治的方法仅有昂贵的造血干细胞移植,为家庭和社会带来沉重负担。目前产前诊断主要依赖绒毛活检、经羊膜腔羊水穿刺及脐血穿刺等有创方法获取胎儿信息进行疾病预防。但是有创的检测方法存在流产、检测时间窗较窄、实验室诊断周期较长、工作量大等缺陷。因此早期、快速、精准、无创、安全的检测分析方法对于诊断胎儿β地中海贫血具有重要的临床意义。目的:通过对无创产前检测(non-invasive prenatal testing,NIPT)诊断胎儿β地中海贫血的灵敏度和特异度进行Meta分析,评价无创产前检测诊断胎儿β地中海贫血的价值。方法:通过检索Pub Med、Embase、Cochrane Library、Ovid等英文数据库,以及万方数据库、中国知网(CNKI)、中国生物医学文献数据库(CBM)、维普数据库(VIP)等中文数据库获取相关文献。检索年限为从建库到2020年10月,检索不限定出版日期,语言限定为中文和英文。纳入文献为前瞻性评估无创产前检测诊断胎儿β地中海贫血的相关研究。采用Endnote X9.0对获取文献按照纳入与排除标准进行筛选。采用诊断性试验准确性质量评价(QUADAS)标准量表进行文献质量评价。采用Stata 16.0对纳入文献的研究资料进行统计学分析。结果:本研究共纳入13篇文献,包含8篇英文文献和5篇中文文献,总共676例病例。纳入的研究文献总体质量良好。Meta分析结果显示NIPT应用于诊断胎儿β地中海贫血的灵敏度为94%(95%CI=0.89-0.97;I=48.58%),特异度为86%(95%CI=0.80-0.90;I=38.35%),阳性似然比为6.68(95%CI=4.56-9.77;I=1.18%),阴性似然比为0.07(95%CI=0.04-0.13;I=41.30%)。汇总受试者工作曲线下面积为0.95(95%CI=0.93-0.97)。Deeks’检验结果提示不存在发表偏倚(P=0.61)。研究结果稳定可靠,异质性小,发表偏倚不明显。亚组分析显示,基于基因分析的测序检测方法与基于PCR的实验室常规检测方法的灵敏度相当(合并灵敏度均为94%),而利用基于基因分析的测序检测方法可获得更高的特异度(合并特异度87%vs 86%);QIAamp Circulating Nucleic Acid kit提取cff DNA各项指标均优于QIAamp DNA mini kit(合并灵敏度96%vs 90%;特异度90%vs 86%,SROC曲线下面积0.94 vs 0.91)。结论:1.在胎儿β地中海贫血诊断中,无创产前检测(NIPT)具有很好的灵敏度和特异度。2.在NIPT诊断胎儿β地中海贫血的检测方法中,基于PCR的实验室常规检测方法与基于基因分析的测序检测方法的灵敏度相当,而基于基因分析的测序检测方法可获得更高的特异度。3.在NIPT诊断胎儿β地中海贫血提取cff DNA的方法中,QIAamp Circulating Nucleic Acid kit提取cff DNA各项指标均优于QIAamp DNA mini kit。

关键词： 高通量测序技术   地中海贫血   湖南汝城县   基因分析  

摘要： 目的:了解湖南汝城人群地中海贫血（简称地贫）基因携带率、基因突变类型及构成比,为汝城县地贫防控提供数据参考。方法:收集2017年1月～2019年12月在湖南省汝城县各医院进行检查的人群7674例,通过血常规五分类和血红蛋白电泳进行地贫初筛,筛查阳性者,进一步通过高通量测序技术进行地贫基因分析,统计地贫在该地区的携带率、基因突变类型及构成比。对夫妻携带同型地贫可能孕育中重型地贫患儿的孕妇进行地贫基因产前诊断。结果:1.7674例样本中共检出615例地贫,地贫携带率为8.01%。其中α-地贫365例、β-地贫223例、αβ复合型地贫27例,占比分别为4.76%、2.91%、0.35%。另检出3例异常血红蛋白,占比0.04%。2.共检出26种地贫基因突变类型,包括17种常见和9种罕见变异类型。α-地贫共检出11种基因变异类型,包括4种缺失型突变和7种非缺失型突变,以缺失型突变--SEA/αα为主,占比69.32%。β-地贫共检出13种突变类型,包括12种点突变和1种缺失型突变,以Codons41/42（-TTCT）和IVS-Ⅱ-654（C>T）突变为主,占比分别为34.53%、31.39%。αβ复合型地贫共涉及17种组合类型,以-α3.7/αα复合Codons41/42（-TTCT）为最常见的组合类型,占比23.53%。3.共有32例孕妇接受了地贫产前基因检查,共检出中重型地贫10例,包括Hb H病3例,重型α-地贫5例,中重型β-地贫2例。结论:1.湖南汝城县地贫基因携带率为8.01%,其中α-地贫、β-地贫、αβ复合型地贫的基因携带率分别为4.76%、2.91%、0.35%。2.湖南汝城县地贫基因类型多样,共检出26种基因突变类型,包括17种常见和9种罕见变异类型。α-地贫最常见的为缺失型突变,其基因型主要为--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα;β-地贫最常见的为点突变型,其基因型主要为:Codons41/42（-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（C>T）、-28（A>G）。另检出3例异常血红蛋白。3.在地贫高发区,利用高通量测序技术进行地贫基因检测,可提高罕见地贫的检出率,有效避免漏检。

关键词： 地中海贫血   输血   不良反应   安全管理   预防  

摘要： 目的:分析地中海贫血输血中常见的不良反应,并提出相应的预防措施.方法:分析病例选择于2019.10～2020.10时间段在我院接收的300例地中海贫血患者,以输血管理方式不同为依据实施分组,例数均分,实施传统管理方法、安全管理方法的病例所在组分别以对照、实验组进行命名,对2种管理方法的实施效果进行比较和分析.结果:相对比于对照组,实验组患者输血不良反应发生率降低明显,病例管理满意度提升明显,比较差异性明显(P<0.05).结论:地中海贫血输血常常会发生各种不良反应,对其实施安全管理方法可对不良反应进行预防,建议推广.

关键词： 血常规   血红蛋白电泳   地中海贫血基因  

摘要： 目的:探讨血常规检查,红细胞平均体积(mean corpusular volume,MCV)、红细胞平均血红蛋白(mean corpuscularhemoglobin,MCH)、红细胞(red blood cell,RBC)、血红蛋白(hemoglobin,Hb)等指标联合血红蛋白电泳A2检测在地中海贫血筛查中的可行性。方法:收集我院2017年8月—2020年4月同时进行血常规、血红蛋白电泳及地中海贫血基因三项都筛查的孕检对象共140例,根据基因反馈结果,以是否出现地中海贫血基因正常情况进行分组,地中海贫血基因正常为对照组(n=70),地中海贫血基因异常为观察组(n=70),对其血常规中的MCV、MCH、RBC、Hb 4项指标及血红蛋白电泳A2结果进行回顾性整理分析。结果:观察组的MCV、MCH、RBC、Hb、HbA2及MCV+MCH+HbA2三者之一异常率高于对照组,差异显著(P<0.05);血常规中的RBC、Hb指标主要用于判定是否贫血或贫血的程度,MCV、MCH指标与血红蛋白电泳A2联合检测结果,用于指导送检地中海贫血基因,对照组与观察组具有显著差异(P<0.01)。结论:地中海贫血基因筛查中,可以通过血常规联合血红蛋白电泳进行监测,能够有效发现地中海贫血基因异常情况。

关键词： 地中海贫血   疾病筛查   筛查模式  

摘要： 地中海贫血症常见于我国南方地区,主要集中在广东、广西、海南、福建、贵州、重庆、四川、云南、江西、湖南这10个省(区、市),其中两广地区——广东、广西是地贫发生率最高的。据不完全统计,我国南方地区地贫基因携带者高达3000万人,共有重型、中间型地贫患者共计30万人左右,其中重型地贫患者有1.5万人左右,从这些数据来看,疾病流行情况形式十分严峻。随着我国政府对人民健康状况的愈加重视,2018年,国家卫健委的《关于印发全国出生缺陷综合防治方案的通知》(国卫办妇幼发201819号)中,明确提出要求“在南方10个高发省份深入开展地中海贫血筛查项目,逐步扩大覆盖范围”。地中海贫血疾病是一个可以被筛查和被治愈的疾病,筛查工作如果做得到位,那么可以杜绝这类疾病的发生,所以地中海贫血筛查工作已经得到了越来越多执行组织、老百姓的关注,政府关于地中海贫血筛查体系的工作目前仍然有很多不足之处。因此,发现实践中政府关于地中海贫血筛查体系的不足之处并加以改善,可以更有效地进行筛查,并且对于我国卫生工作和人民健康事业的发展,具有重要的现实意义和历史意义。随着各省公共卫生层面的工作推进,在开展过程中暴露出现有筛查模式的相关问题,主要表现在“筛查过程中采取的筛查技术需要进行更新、筛查过程中的流程需要进行优化、筛查过程中医疗数据管理需要进一步提升”等方面。本项研究通过对目前我国两广地区——广东、广西政府地中海贫血筛查模式进行分析,发现我国现有两广地区地中海贫血筛查存在的问题,通过借鉴其他国家的筛查措施,提出两广地区地中海贫血筛查模式。并提出具体政策建议:(1)针对观念保守的地区采取折中模式,只对检测技术进行革新;(2)采取稳健模式对现有筛查流程进行集约化管理,不仅对检测技术进行革新,还采用全新的筛查流程;(3)采取前瞻模式对筛查数据进行管理与挖掘,不仅对检测技术进行革新、筛查流程进行更新,还对疾病数据进行管理。最后,根据三种创新模式,提出相应的实施策略。

关键词： 地中海贫血   产前诊断   珠蛋白基因   MLPA方法  

摘要： 地中海贫血(地贫)是一种由于珠蛋白基因突变引起珠蛋白链合成减少的慢性溶血性遗传病。全世界约5%的人群为地贫携带者，据世界卫生组织估计，全球每年约有5,000例HbBart’s水肿胎和23,000例重型β-地贫患儿出生，因此地贫是全球严重的公共卫生问题。上世纪70年代以来，塞浦路斯、希腊、泰国、新加坡等国在地贫防控方面已取得了显著成效。我国广东人群α-地贫的基因携带率约12.70%，β-地贫基因携带率约4.20%。目前国内高发地区陆续实行国家或区域级地贫防控政策，多地区尤其是两广地区相继报道了地贫防控的效果。婚前、孕前或产前早期通过地贫携带者筛查、分子诊断尽早识别出高风险家庭，在充分遗传咨询后对高风险妊娠进行产前诊断明确胎儿地贫基因型可有效降低严重地贫患儿的出生。本中心自1990年始逐渐建立起基于医院水平的产前筛查和产前诊断流程。本文总结分析了本中心近10年地贫产前诊断数量的变化、产前诊断孕周分布，以期反映地贫防控效果及可能存在的缺陷，为下一步地贫防控工作提供科学依据。　　目的　　统计过去十年间（2010-2019）在本中心进行侵入性地贫产前诊断（指征为HbBart’s水肿胎、非缺失型HbH病或严重β-地贫的高危妊娠）的病例，旨在观察产前诊断数量变化趋势及产前诊断孕周分布等特征，进行回顾性分析。　　方法　　1.收集2010年1月1日至2019年12月31日在广州市妇儿中心产前诊断中心进行地贫产前诊断的临床病例资料。根据产前诊断指征，4,593例地贫高危妊娠病例纳入研究。　　2.统计分析产前诊断病例夫妇双方β-地贫中检出的各基因型频率，包括罕见型地贫产前诊断的类型和数量。　　3.逐年统计分析每年胎儿为HbBart’s水肿胎、非缺失型HbH病(除HbH-Westmead外)、严重β-地贫高危产前诊断的病例数。　　4.按产前诊断孕周将每年的地贫产前诊断病例分为10-14周、15-19周、20-24周、≥25周4组，逐年统计各组的总例数，分析近10年不同产前诊断孕周的分布变化。　　结果　　1.在研究期间，本中心产前诊断病例的总数为34,980例，其中有地贫临床指征的产前诊断例数为4,593例（13.1%）。在4,593对地贫产前诊断的家庭中，胎儿为HbBart’s水肿胎高危2,444例，非缺失型HbH病高危277例，β-地贫高风险1,872例。孕妇产龄的范围是15-46岁，中位数是28岁;产前诊断孕周的分布范围是10-38周,中位数是孕13周。　　2.在双方β-地贫的夫妇中，五种常见的基因型为CD41/42(-TCTT)、IVS-Ⅱ-654(C＞T)、-28(A＞G)、CD17(A＞T)、CD71/72(+A)，其杂合子占β-地贫的比例分别是39.8%、29.9%、13.0%、10.1%、3.10%，占所有地贫携带者的95.9%。另外罕见型地贫产前诊断病例共47例，占地贫产前诊断的1.0%。其中罕见型α-地贫23例，突变频率最高的为--THAI。罕见型β-地贫24例，频率最高的突变类型为CD37(G＞A)。　　3.2010年至2019年，HbBart’s水肿胎高危产前诊断例数从98例增加至335例，非缺失型HbH病高危妊娠例数从11增加至49例，严重β-地贫高危胎儿的数量从112例增加到231例。HbBart’s水肿胎、非缺失型HbH病、严重β-地贫高风险的例数呈逐年增加的趋势。　　4.研究期间，α-地贫和β-地贫孕早期产前诊断的病例逐年增加。在α-地贫产前诊断病例，绒毛穿刺的比例从开始的53.2%缓慢增加至67.7%，呈现平缓增加趋势。在β-地贫基因产前诊断的病例，绒毛穿刺的比例从开始的34.8%增加至64.1%，呈现出逐年稳定升高的趋势。此外，研究期间总计共2640(57.5%)例病例在孕早期行地贫产前诊断，266(5.80%)例病例在孕25周后才进行侵入性产前诊断。　　5.根据产前诊断结果，胎儿为HbBart’s水肿胎898(36.7%)例，非缺失型HbH病78(28.2%)例，严重β-地贫458(24.5%)例。所有HbBart’s水肿胎病例都终止妊娠，　　非缺失型HbH病和严重β-地贫终止妊娠的例数分别是75（96.2%）和456（99.6%）例。在终止妊娠病例里，孕11-14周终止妊娠805（56.3%）例，孕15-19周终止妊娠387（27.1%）例，孕20-24周终止妊娠154（10.8%）例，≥孕25周终止妊娠83（5.80%）例，总计共1,429例严重地贫病例及时终止妊娠。仍有5例严重地贫胎儿出生。　　结论　　1.本研究在4,546例地贫高危妊娠实施产前诊断，检测出HbBart’s水肿胎898例、非缺失型HbH病78例及严重β-地贫458例，共终止妊娠1,429例，显著降低了出生缺陷。　　2.本研究发现产前诊断病例数

关键词： 地中海贫血   孕妇   基因分型   平均红细胞体积   平均血红蛋白含量   血红蛋白电泳  

摘要： 目的: 探索红细胞参数MCV和MCH用于四川地区孕妇地中海贫血（简称地贫）筛查的截断值,并以基因检测作为地贫诊断金标准,分析MCV/MCH、血红蛋白（Hb）电泳、MCV/MCH联合Hb电泳三种筛查方案对筛查孕妇地贫的价值。 方法: 纳入2019年7月～2020年12月在四川大学华西第二医院产科门诊建卡且血常规红细胞参数MCV≤90fl或MCH≤29pg的554名孕妇作为研究组,进行血清铁蛋白检测、毛细管Hb电泳检查及地中海贫血基因检测;并随机抽取我院2017年～2018年无妊娠合并症和严重妊娠并发症、无输血史和创伤史、且经基因检测排除地贫的640名孕妇作为对照组。使用SPSS软件绘制受试者工作特性曲线（ROC曲线）,确定筛查孕妇地贫的MCV和MCH截断值及效能,并以基因检测结果为金标准,比较分析MCV/MCH、Hb电泳、MCV/MCH联合Hb电泳三种筛查方案的灵敏度、特异度、漏诊率,确定适合四川地区孕妇地贫筛查的最佳方案。 结果: 1.研究组地贫患病率及基因型分布情况:本研究共纳入地贫高危孕妇554人,经3种常见α-地贫基因缺失检测、3种α-地贫基因突变检测、17种常见β-地贫基因突变检测,确诊地贫159人,患病率28.8%;其中α-地贫108人（67.92%,108/159）,β-地贫47人（29.56%,47/159）,α-合并β-地贫4人（2.52%,4/159）;α-地贫以-α3.7/αα杂合缺失型（29.56%,47/159）和--SEA/αα杂合缺失型（27.67%,44/159）最多见,β-地贫以CD17杂合突变型（11.32%,18/159）最多见。 2.研究对象红细胞参数及血清铁蛋白分析:（1）研究组159名地贫孕妇的Hb（114.6±13.08g/l）、MCV(70.3（65.3～81.6）fl)和MCH(22.8（20.9～27.2）pg)分别低于对照组孕妇的Hb（126.3±8.33g/l）、MCV(88.7（81.6～95.5）fl)和MCH(30.5（27.2～32.8）pg),差异均有统计学意义（P=0.000）;地贫孕妇的SF(75.7（41.0～135.4）ug/l)高于对照组孕妇(64.3（11.4～230.9）ug/l),差异有统计学意义（P=0.000）。（2）α-地贫孕妇的Hb（119.5±10.50g/l）分别高于β-地贫孕妇（104.3±12.37g/l）、α-合并β-地贫孕妇（103.8±6.60g/l）,差异均有统计学意义（P=0.000,P=0.004）;α-地贫孕妇的MCV(79.5（68.3～83.3）fl)和MCH(26.1（22.1～27.6）pg)分别高于β-地贫孕妇(64.5（61.4～69.9）fl,20.6（19.8～22.4）pg),差异均有统计学意义（P=0.000）;α-地贫孕妇的SF(65.1（31.7～103.7）ug/l)低于β-地贫孕妇(114.8（73.0～155.5）ug/l),差异有统计学意义（P=0.000）。（3）-α3.7/αα地贫孕妇的MCV(83.2（81.1～85.3）fl)和MCH(27.4（26.5～27.9）pg)分别高于--SEA/αα杂合缺失型地贫孕妇(68.1（65.4～69.2）fl,21.9（21.0～22.3）pg),差异均有统计学意义（P=0.000）;-α3.7/αα地贫孕妇的SF(67.4（35.3～104.0）ug/l)与--SEA/αα地贫孕妇(59.7（24.2～99.7）ug/l)比较,差异无统计学意义（P=0.473）。 3.确定MCV和MCH筛查孕妇地贫的截断值:分别绘制554名研究组孕妇MCV和MCH的ROC曲线;MCV的AUC为0.910（95%CI:0.883-0.938）,约登指数最大为0.67,所对应的MCV截断值为84.4fl,此截断值下MCV筛查地贫的灵敏度为0.90,特异度为0.78;MCH的AUC为0.931（95%CI:0.910-0.952）,约登指数最大为0.74,所对应的MCH截断值为28.1pg,该截断值下MCH筛查地贫的灵敏度为0.92,特异度为0.81。 4.不同的MCV、MCH截断值对孕妇地贫的筛查效能比较:MCV、MCH截断值取84.4fl和28.1pg（本研究确定的截断值）、79fl和27pg（2012年地中海贫血国际联合会推荐的截断值）、80fl和27pg（2020年我国地中海贫血临床实践指南推荐的截断值）、82fl和27pg（2020年我国地中海贫血妊娠期管理专家共识推荐的截断值）时,MCV/MCH筛查孕妇地贫的灵敏度分别为0.937、0.736、0.736、0.786,特异度分别为0.754、0.889、0.889、0.848,漏诊率分别为6.3%、

关键词： β地中海贫血   基因编辑   HBB-28突变位点   慢病毒载体   插入位点分析  

摘要： β地中海贫血（β地贫）是由β珠蛋白基因（Hemoglobinsubunitbeta，HBB）突变引起的一种常染色体单基因隐性遗传性疾病。HBB-28(A＞G)突变是我国南方高发的五个位点之一，目前针对该突变位点分子机理的深入研究鲜有报道。另外，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术纠正内源HBB基因突变位点，以及利用慢病毒载体导入外源HBB基因表达是现阶段地贫基因治疗的两种主要策略。针对内源HBB突变的研究，由于缺少同基因型背景的研究材料而无法深入研究，有待利用CRISPR/Cas9无痕点突变技术构建相应细胞模型来推进;基于慢病毒载体的基因治疗虽有成功报道案例和上市产品，还存在病毒包装和感染效率偏低、费用高昂等问题;其安全性评估目前常用生物素捕获的方法，精确度较低、步骤复杂且耗时长。因此，为拓展基因编辑技术在β地中海贫血研究中的应用、提高慢病毒载体的有效性以及从全基因组范围评估其安全性，本论文开展相应的探索研究。主要研究结果如下:　　1.内源性基因无缝无痕纠正方法的建立及研究　　1)首先针对我国常见的突变位点HBB-28(A＞G)进行编辑，通过CRISPR/Cas9结合不对称单链寡脱氧核苷酸的方法，在K562细胞系中建立一套无缝无痕的点突变基因编辑系统，Sanger测序表明HBB-28位点的碱基是单峰G，说明包含纯合突变的细胞系K562-28(A＞G)构建成功。　　2)利用同样的编辑策略，对上述突变细胞系HBB-28(A＞G)位点进行原位纠正，Sanger测序表明HBB-28(A＞G)位点恢复为A或A/G，证明本研究建立的编辑策略可实现HBB-28(A＞G)突变的原位无缝无痕修复。　　3)为进一步研究HBB-28(A＞G)突变对血红蛋白表达的影响，本研究利用lnM正丁酸钠体系对同基因型背景的K562-28(A＞G)突变系与K562细胞系进行红系分化诱导，通过qRT-PCR、ELISA、流式细胞分析及细胞形态学特征分析了红系分化过程中HBBmRNA表达水平、HBB蛋白表达水平和细胞表面标记蛋白表达水平，结果证明本研究构建的纯合突变细胞系可用作为β地贫模型开展相关研究。　　4)利用高通量RNA-seq技术，对同基因型背景下K562-28(A＞G)突变系与K562细胞系在红系分化前后的转录组进行差异分析。结果表明，HBB-28(A＞G)突变在分化前主要受到低氧的影响;在分化后，突变不影响整个红系分化进程，但会引起关键通路的缺陷，如氧气交换、运输，血小板聚集等。　　2.慢病毒载体的有效性和全基因组范围内安全性评估方法建立　　1)利用上述构建的地贫突变细胞系K562-28(A＞G)，对4个慢病毒载体结构进行初步优化和筛选，通过病毒滴度检测和感染后的HBB表达量分析，筛选出含有T87Q珠蛋白基因（HBBT87Q）、重组基因座控制区域(rLCR)和CMV启动子的慢病毒载体Lenti-BGI102，病毒包装能力和感染能力最强。　　2)为了评估基于慢病毒体系的基因治疗的安全性，本研究采用锚定PCR的策略进行全基因组范围内的插入位点序列富集，通过设计独特的分子标签序列，结合BGI测序平台，实现对插入位点定量的分析。建立50ng起始量、10h完成文库构建、1/300低频插入检测的测序方法。对本研究筛选出的慢病毒载体包装病毒感染后的造血干细胞进行分析，发现插入位点在全基因组内的染色体分布、插入转录起始位点及碱基偏好性与已发表的数据一致，说明本评估方法可靠。癌基因与抑癌基因Panel及异常扩增分析并未发现致癌性和异常扩增，表明本研究中筛选的慢病毒载体相对安全。　　综上所述，围绕β地贫的基因治疗，本研究建立了针对HBB-28(A＞G)位点有效的CRISPR/Cas9基因编辑策略，成功构建纯合突变的疾病模型细胞系，并首次基于同基因型细胞系在转录组水平分析HBB-28(A＞G)突变的影响，加深对β地贫关键突变的功能理解。基于突变细胞系，筛选出用于基因治疗的Lenti-BGI102结构，为后续临床研究奠定了基础。本研究所建立的全基因组范围内的插入位点评估方法有效可靠且可分析功能全面，将在临床研究中用于造血干细胞克隆追踪、长期安全监控等方面。总之，本研究为β地贫的基因治疗应用提供良好的研究模型与技术支持，具有重要的科学研究意义和应用价值。