关键词： 无创产前检测   β地中海贫血   产前诊断   meta分析  

摘要： 研究背景:β地中海贫血(beta-thalassemia)是世界上最常见的常染色体单基因遗传病之一,β地中海贫血患儿的疾病分型为中重型时,患儿在出生后3-6月可能出现溶血性贫血症状,随着年龄增大会逐渐加重,缺乏特异性治疗手段,患儿需要依赖长期定期或不定期输血和祛铁治疗存活,根治的方法仅有昂贵的造血干细胞移植,为家庭和社会带来沉重负担。目前产前诊断主要依赖绒毛活检、经羊膜腔羊水穿刺及脐血穿刺等有创方法获取胎儿信息进行疾病预防。但是有创的检测方法存在流产、检测时间窗较窄、实验室诊断周期较长、工作量大等缺陷。因此早期、快速、精准、无创、安全的检测分析方法对于诊断胎儿β地中海贫血具有重要的临床意义。目的:通过对无创产前检测(non-invasive prenatal testing,NIPT)诊断胎儿β地中海贫血的灵敏度和特异度进行Meta分析,评价无创产前检测诊断胎儿β地中海贫血的价值。方法:通过检索Pub Med、Embase、Cochrane Library、Ovid等英文数据库,以及万方数据库、中国知网(CNKI)、中国生物医学文献数据库(CBM)、维普数据库(VIP)等中文数据库获取相关文献。检索年限为从建库到2020年10月,检索不限定出版日期,语言限定为中文和英文。纳入文献为前瞻性评估无创产前检测诊断胎儿β地中海贫血的相关研究。采用Endnote X9.0对获取文献按照纳入与排除标准进行筛选。采用诊断性试验准确性质量评价(QUADAS)标准量表进行文献质量评价。采用Stata 16.0对纳入文献的研究资料进行统计学分析。结果:本研究共纳入13篇文献,包含8篇英文文献和5篇中文文献,总共676例病例。纳入的研究文献总体质量良好。Meta分析结果显示NIPT应用于诊断胎儿β地中海贫血的灵敏度为94%(95%CI=0.89-0.97;I=48.58%),特异度为86%(95%CI=0.80-0.90;I=38.35%),阳性似然比为6.68(95%CI=4.56-9.77;I=1.18%),阴性似然比为0.07(95%CI=0.04-0.13;I=41.30%)。汇总受试者工作曲线下面积为0.95(95%CI=0.93-0.97)。Deeks’检验结果提示不存在发表偏倚(P=0.61)。研究结果稳定可靠,异质性小,发表偏倚不明显。亚组分析显示,基于基因分析的测序检测方法与基于PCR的实验室常规检测方法的灵敏度相当(合并灵敏度均为94%),而利用基于基因分析的测序检测方法可获得更高的特异度(合并特异度87%vs 86%);QIAamp Circulating Nucleic Acid kit提取cff DNA各项指标均优于QIAamp DNA mini kit(合并灵敏度96%vs 90%;特异度90%vs 86%,SROC曲线下面积0.94 vs 0.91)。结论:1.在胎儿β地中海贫血诊断中,无创产前检测(NIPT)具有很好的灵敏度和特异度。2.在NIPT诊断胎儿β地中海贫血的检测方法中,基于PCR的实验室常规检测方法与基于基因分析的测序检测方法的灵敏度相当,而基于基因分析的测序检测方法可获得更高的特异度。3.在NIPT诊断胎儿β地中海贫血提取cff DNA的方法中,QIAamp Circulating Nucleic Acid kit提取cff DNA各项指标均优于QIAamp DNA mini kit。

关键词： 高通量测序技术   地中海贫血   湖南汝城县   基因分析  

摘要： 目的:了解湖南汝城人群地中海贫血(简称地贫)基因携带率、基因突变类型及构成比,为汝城县地贫防控提供数据参考。方法:收集2017年1月～2019年12月在湖南省汝城县各医院进行检查的人群7674例,通过血常规五分类和血红蛋白电泳进行地贫初筛,筛查阳性者,进一步通过高通量测序技术进行地贫基因分析,统计地贫在该地区的携带率、基因突变类型及构成比。对夫妻携带同型地贫可能孕育中重型地贫患儿的孕妇进行地贫基因产前诊断。结果:1.7674例样本中共检出615例地贫,地贫携带率为8.01%。其中α-地贫365例、β-地贫223例、αβ复合型地贫27例,占比分别为4.76%、2.91%、0.35%。另检出3例异常血红蛋白,占比0.04%。2.共检出26种地贫基因突变类型,包括17种常见和9种罕见变异类型。α-地贫共检出11种基因变异类型,包括4种缺失型突变和7种非缺失型突变,以缺失型突变--/αα为主,占比69.32%。β-地贫共检出13种突变类型,包括12种点突变和1种缺失型突变,以Codons41/42(-TTCT)和IVS-Ⅱ-654(C>T)突变为主,占比分别为34.53%、31.39%。αβ复合型地贫共涉及17种组合类型,以-α/αα复合Codons41/42(-TTCT)为最常见的组合类型,占比23.53%。3.共有32例孕妇接受了地贫产前基因检查,共检出中重型地贫10例,包括Hb H病3例,重型α-地贫5例,中重型β-地贫2例。结论:1.湖南汝城县地贫基因携带率为8.01%,其中α-地贫、β-地贫、αβ复合型地贫的基因携带率分别为4.76%、2.91%、0.35%。2.湖南汝城县地贫基因类型多样,共检出26种基因突变类型,包括17种常见和9种罕见变异类型。α-地贫最常见的为缺失型突变,其基因型主要为--/αα、-α/αα、-α/αα;β-地贫最常见的为点突变型,其基因型主要为:Codons41/42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、-28(A>G)。另检出3例异常血红蛋白。3.在地贫高发区,利用高通量测序技术进行地贫基因检测,可提高罕见地贫的检出率,有效避免漏检。

关键词： β-地中海贫血   突变检测   熔解阵列分析   多色探针熔解曲线分析  

摘要： β-地中海贫血(β-thalassemia)是一种严重危害人类健康的血红蛋白隐性遗传疾病,由β-珠蛋白(Human β-globin,HBB)基因突变导致。在全世界大约有1.5%的人群携带此突变,中国与东南亚、南亚地区都属于β-地中海贫血症高发地。该病的治疗方法有限,尽早进行诊断,采取遗传风险评估及产前诊断是预后的关键,而进行基因型诊断又是β-地中海贫血症确诊的标准。除基因测序外,当前的技术方法难以对突变类型进行快速准确的分型。因此本论文应用熔解阵列分析技术(MeltArray analysis),辅以多色探针熔解曲线分析技术(Multicolor Melting Curve Analysis,MMCA),对中国人群和马尔代夫人群常见的HBB基因突变类型,进行检测技术的应用研究,建立基于实时荧光PCR的快速基因突变检测及分型方法。第一章,分别对β-地中海贫血的定义、分布特点、临床特征、发病机理,以及当前的诊疗方法进行介绍,突出区分突变类型的必要性,并且也指出进行有效的人群预防的重要性。最后,阐述了本论文的研究内容及意义。第二章,将熔解阵列分析技术应用于中国人群β-地中海贫血常见突变的检测。按照当前中国人群β-地中海贫血的现状和国家项目管理规范,针对中国人群常见的17种突变类型,建立了一个突变检测及分型体系,能够在一次反应中检测出野生型与突变型,同时准确区分突变类型。体系检测的重复性良好且检测限低至500拷贝/反应(人类基因组约1.5 ng/反应)。最后,利用545份临床样本进行体系的评价,检测到198份阳性样本共携带12种突变类型,CD41-42(-CTTT)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、-28(A>G)、CD17(A>T)、CD71-72(+AA)、CD26(G>A)、IVS-Ⅰ-1(G>T)、-29(A>G)八种突变约占突变总数的96%,其中前二个突变频率最高。所有的样本均通过MMCA法外加RDB(Reverse Dot Blot)法或者Sanger测序验证,结果一致,体现出体系具有高准确性,检测结果真实可靠。第三章,对马尔代夫人群β-地中海贫血常见突变类型,应用熔解阵列分析技术结合MMCA技术,建立了一个突变检测及分型体系,可同时对马尔代夫人群10种常见突变进行检测,并且准确区分各突变类型。体系检测限同样能够达到500拷贝/反应(人类基因组约1.5 ng/反应)。挑选各突变基因型共21份临床样本进行体系评价,检测结果均于与验证方法一致。最后,查阅文献整理了东南亚地区国家的β-地中海贫血突变谱,包括柬埔寨、老挝、马来西亚、缅甸、新加坡、印度尼西亚、泰国、越南和文莱等国,发现东南亚各国β-地贫基因突变类型有着极高的相似度,使用前面建立的二个检测体系组合四管联合检测体系,可覆盖这些东南亚国家人群90%以上的突变类型,因此有望形成一个β-地中海贫血基因突变通用检测体系,运用到东南亚地区各国进行人群筛查。

关键词： 地中海贫血   输血   不良反应   安全管理   预防  

摘要： 目的:分析地中海贫血输血中常见的不良反应,并提出相应的预防措施.方法:分析病例选择于2019.10～2020.10时间段在我院接收的300例地中海贫血患者,以输血管理方式不同为依据实施分组,例数均分,实施传统管理方法、安全管理方法的病例所在组分别以对照、实验组进行命名,对2种管理方法的实施效果进行比较和分析.结果:相对比于对照组,实验组患者输血不良反应发生率降低明显,病例管理满意度提升明显,比较差异性明显(P<0.05).结论:地中海贫血输血常常会发生各种不良反应,对其实施安全管理方法可对不良反应进行预防,建议推广.

关键词： 血常规   血红蛋白电泳   地中海贫血基因  

摘要： 目的:探讨血常规检查,红细胞平均体积(mean corpusular volume,MCV)、红细胞平均血红蛋白(mean corpuscularhemoglobin,MCH)、红细胞(red blood cell,RBC)、血红蛋白(hemoglobin,Hb)等指标联合血红蛋白电泳A2检测在地中海贫血筛查中的可行性。方法:收集我院2017年8月—2020年4月同时进行血常规、血红蛋白电泳及地中海贫血基因三项都筛查的孕检对象共140例,根据基因反馈结果,以是否出现地中海贫血基因正常情况进行分组,地中海贫血基因正常为对照组(n=70),地中海贫血基因异常为观察组(n=70),对其血常规中的MCV、MCH、RBC、Hb 4项指标及血红蛋白电泳A2结果进行回顾性整理分析。结果:观察组的MCV、MCH、RBC、Hb、HbA2及MCV+MCH+HbA2三者之一异常率高于对照组,差异显著(P<0.05);血常规中的RBC、Hb指标主要用于判定是否贫血或贫血的程度,MCV、MCH指标与血红蛋白电泳A2联合检测结果,用于指导送检地中海贫血基因,对照组与观察组具有显著差异(P<0.01)。结论:地中海贫血基因筛查中,可以通过血常规联合血红蛋白电泳进行监测,能够有效发现地中海贫血基因异常情况。

关键词： 地中海贫血   孕妇   基因分型   平均红细胞体积   平均血红蛋白含量   血红蛋白电泳  

摘要： 目的: 探索红细胞参数MCV和MCH用于四川地区孕妇地中海贫血（简称地贫）筛查的截断值,并以基因检测作为地贫诊断金标准,分析MCV/MCH、血红蛋白（Hb）电泳、MCV/MCH联合Hb电泳三种筛查方案对筛查孕妇地贫的价值。 方法: 纳入2019年7月～2020年12月在四川大学华西第二医院产科门诊建卡且血常规红细胞参数MCV≤90fl或MCH≤29pg的554名孕妇作为研究组,进行血清铁蛋白检测、毛细管Hb电泳检查及地中海贫血基因检测;并随机抽取我院2017年～2018年无妊娠合并症和严重妊娠并发症、无输血史和创伤史、且经基因检测排除地贫的640名孕妇作为对照组。使用SPSS软件绘制受试者工作特性曲线（ROC曲线）,确定筛查孕妇地贫的MCV和MCH截断值及效能,并以基因检测结果为金标准,比较分析MCV/MCH、Hb电泳、MCV/MCH联合Hb电泳三种筛查方案的灵敏度、特异度、漏诊率,确定适合四川地区孕妇地贫筛查的最佳方案。 结果: 1.研究组地贫患病率及基因型分布情况:本研究共纳入地贫高危孕妇554人,经3种常见α-地贫基因缺失检测、3种α-地贫基因突变检测、17种常见β-地贫基因突变检测,确诊地贫159人,患病率28.8%;其中α-地贫108人（67.92%,108/159）,β-地贫47人（29.56%,47/159）,α-合并β-地贫4人（2.52%,4/159）;α-地贫以-α3.7/αα杂合缺失型（29.56%,47/159）和--SEA/αα杂合缺失型（27.67%,44/159）最多见,β-地贫以CD17杂合突变型（11.32%,18/159）最多见。 2.研究对象红细胞参数及血清铁蛋白分析:（1）研究组159名地贫孕妇的Hb（114.6±13.08g/l）、MCV(70.3（65.3～81.6）fl)和MCH(22.8（20.9～27.2）pg)分别低于对照组孕妇的Hb（126.3±8.33g/l）、MCV(88.7（81.6～95.5）fl)和MCH(30.5（27.2～32.8）pg),差异均有统计学意义（P=0.000）;地贫孕妇的SF(75.7（41.0～135.4）ug/l)高于对照组孕妇(64.3（11.4～230.9）ug/l),差异有统计学意义（P=0.000）。（2）α-地贫孕妇的Hb（119.5±10.50g/l）分别高于β-地贫孕妇（104.3±12.37g/l）、α-合并β-地贫孕妇（103.8±6.60g/l）,差异均有统计学意义（P=0.000,P=0.004）;α-地贫孕妇的MCV(79.5（68.3～83.3）fl)和MCH(26.1（22.1～27.6）pg)分别高于β-地贫孕妇(64.5（61.4～69.9）fl,20.6（19.8～22.4）pg),差异均有统计学意义（P=0.000）;α-地贫孕妇的SF(65.1（31.7～103.7）ug/l)低于β-地贫孕妇(114.8（73.0～155.5）ug/l),差异有统计学意义（P=0.000）。（3）-α3.7/αα地贫孕妇的MCV(83.2（81.1～85.3）fl)和MCH(27.4（26.5～27.9）pg)分别高于--SEA/αα杂合缺失型地贫孕妇(68.1（65.4～69.2）fl,21.9（21.0～22.3）pg),差异均有统计学意义（P=0.000）;-α3.7/αα地贫孕妇的SF(67.4（35.3～104.0）ug/l)与--SEA/αα地贫孕妇(59.7（24.2～99.7）ug/l)比较,差异无统计学意义（P=0.473）。 3.确定MCV和MCH筛查孕妇地贫的截断值:分别绘制554名研究组孕妇MCV和MCH的ROC曲线;MCV的AUC为0.910（95%CI:0.883-0.938）,约登指数最大为0.67,所对应的MCV截断值为84.4fl,此截断值下MCV筛查地贫的灵敏度为0.90,特异度为0.78;MCH的AUC为0.931（95%CI:0.910-0.952）,约登指数最大为0.74,所对应的MCH截断值为28.1pg,该截断值下MCH筛查地贫的灵敏度为0.92,特异度为0.81。 4.不同的MCV、MCH截断值对孕妇地贫的筛查效能比较:MCV、MCH截断值取84.4fl和28.1pg（本研究确定的截断值）、79fl和27pg（2012年地中海贫血国际联合会推荐的截断值）、80fl和27pg（2020年我国地中海贫血临床实践指南推荐的截断值）、82fl和27pg（2020年我国地中海贫血妊娠期管理专家共识推荐的截断值）时,MCV/MCH筛查孕妇地贫的灵敏度分别为0.937、0.736、0.736、0.786,特异度分别为0.754、0.889、0.889、0.848,漏诊率分别为6.3%、

关键词： β地中海贫血   基因编辑   HBB-28突变位点   慢病毒载体   插入位点分析  

摘要： β地中海贫血（β地贫）是由β珠蛋白基因（Hemoglobinsubunitbeta，HBB）突变引起的一种常染色体单基因隐性遗传性疾病。HBB-28(A＞G)突变是我国南方高发的五个位点之一，目前针对该突变位点分子机理的深入研究鲜有报道。另外，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术纠正内源HBB基因突变位点，以及利用慢病毒载体导入外源HBB基因表达是现阶段地贫基因治疗的两种主要策略。针对内源HBB突变的研究，由于缺少同基因型背景的研究材料而无法深入研究，有待利用CRISPR/Cas9无痕点突变技术构建相应细胞模型来推进;基于慢病毒载体的基因治疗虽有成功报道案例和上市产品，还存在病毒包装和感染效率偏低、费用高昂等问题;其安全性评估目前常用生物素捕获的方法，精确度较低、步骤复杂且耗时长。因此，为拓展基因编辑技术在β地中海贫血研究中的应用、提高慢病毒载体的有效性以及从全基因组范围评估其安全性，本论文开展相应的探索研究。主要研究结果如下:　　1.内源性基因无缝无痕纠正方法的建立及研究　　1)首先针对我国常见的突变位点HBB-28(A＞G)进行编辑，通过CRISPR/Cas9结合不对称单链寡脱氧核苷酸的方法，在K562细胞系中建立一套无缝无痕的点突变基因编辑系统，Sanger测序表明HBB-28位点的碱基是单峰G，说明包含纯合突变的细胞系K562-28(A＞G)构建成功。　　2)利用同样的编辑策略，对上述突变细胞系HBB-28(A＞G)位点进行原位纠正，Sanger测序表明HBB-28(A＞G)位点恢复为A或A/G，证明本研究建立的编辑策略可实现HBB-28(A＞G)突变的原位无缝无痕修复。　　3)为进一步研究HBB-28(A＞G)突变对血红蛋白表达的影响，本研究利用lnM正丁酸钠体系对同基因型背景的K562-28(A＞G)突变系与K562细胞系进行红系分化诱导，通过qRT-PCR、ELISA、流式细胞分析及细胞形态学特征分析了红系分化过程中HBBmRNA表达水平、HBB蛋白表达水平和细胞表面标记蛋白表达水平，结果证明本研究构建的纯合突变细胞系可用作为β地贫模型开展相关研究。　　4)利用高通量RNA-seq技术，对同基因型背景下K562-28(A＞G)突变系与K562细胞系在红系分化前后的转录组进行差异分析。结果表明，HBB-28(A＞G)突变在分化前主要受到低氧的影响;在分化后，突变不影响整个红系分化进程，但会引起关键通路的缺陷，如氧气交换、运输，血小板聚集等。　　2.慢病毒载体的有效性和全基因组范围内安全性评估方法建立　　1)利用上述构建的地贫突变细胞系K562-28(A＞G)，对4个慢病毒载体结构进行初步优化和筛选，通过病毒滴度检测和感染后的HBB表达量分析，筛选出含有T87Q珠蛋白基因（HBBT87Q）、重组基因座控制区域(rLCR)和CMV启动子的慢病毒载体Lenti-BGI102，病毒包装能力和感染能力最强。　　2)为了评估基于慢病毒体系的基因治疗的安全性，本研究采用锚定PCR的策略进行全基因组范围内的插入位点序列富集，通过设计独特的分子标签序列，结合BGI测序平台，实现对插入位点定量的分析。建立50ng起始量、10h完成文库构建、1/300低频插入检测的测序方法。对本研究筛选出的慢病毒载体包装病毒感染后的造血干细胞进行分析，发现插入位点在全基因组内的染色体分布、插入转录起始位点及碱基偏好性与已发表的数据一致，说明本评估方法可靠。癌基因与抑癌基因Panel及异常扩增分析并未发现致癌性和异常扩增，表明本研究中筛选的慢病毒载体相对安全。　　综上所述，围绕β地贫的基因治疗，本研究建立了针对HBB-28(A＞G)位点有效的CRISPR/Cas9基因编辑策略，成功构建纯合突变的疾病模型细胞系，并首次基于同基因型细胞系在转录组水平分析HBB-28(A＞G)突变的影响，加深对β地贫关键突变的功能理解。基于突变细胞系，筛选出用于基因治疗的Lenti-BGI102结构，为后续临床研究奠定了基础。本研究所建立的全基因组范围内的插入位点评估方法有效可靠且可分析功能全面，将在临床研究中用于造血干细胞克隆追踪、长期安全监控等方面。总之，本研究为β地贫的基因治疗应用提供良好的研究模型与技术支持，具有重要的科学研究意义和应用价值。

关键词： 儿童   地中海贫血   造血干细胞移植   HLA配型   ABO血型   预后  

摘要： 地中海贫血是儿童最常见的一种遗传性血液系统疾病,根据基因型的不同可分为以下4种类型:α-地中海贫血、β-地中海贫血、δβ-地中海贫血、δ-地中海贫血以及其他少见的地中海贫血,其中α-及β-地中海贫血最常见。慢性溶血性贫血是地中海贫血主要的临床表现,根据临床表现的严重程度将β-地中海贫血分为轻型、中间型和重型。造血干细胞移植是目前β-重型地中海贫血唯一根治方案。人类白细胞抗原(HLA)在造血干细胞移植中起着至关重要的作用,HLA配型结果是造血干细胞移植供者选择的重要标准。根据国内外相关研究报道,HLA全相合移植是地中海贫血患者移植首选,然而这只是理想状态,国内很多重型β-地中海贫血患者无法匹配到HLA全相合供者,由于病情需要只能选择HLA配型不全相合或者HLA配型半相合供者。ABO血型不合在器官移植中是禁忌症,但在造血干细胞移植中很常见。目前ABO血型不合对造血干细胞移植的影响还没有统一结论。为了分析HLA配型结果、供受者ABO血型对于移植后生存状态、干细胞植入成功率、造血重建时间以及移植后并发症发生率的影响,收集了来自广东省广州市南方医科大学附属南方医院自2013年01月1日到2018年12月31日收治的257例重型β-地中海贫血患者的治疗数据。根据HLA配型结果将病例分为HLA全相合组、HLA不全相合组及HLA半相合组。在各组中根据供者、受者ABO血型关系分为血型相合组、血型主要不合组、血型次要不合组。收集数据资料采用统计软件SPSS 20.0进行数据整理分析,设置p<0.05有统计学意义。计量资料采用t检验或者秩和检验,组间比较采用χ2检验,发生率比较、植入状态采用χ2检验,造血重建时间使用秩和检验,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。分析数据发现无病生存率、干细胞植入状态、移植物抗宿主病发生率以及造血重建时间与HLA配型相合程度相关。HLA全相合组无病生存率显著高于HLA半相合组。与HLA全相合、不全相合组对比,HLA半相合组移植后干细胞植入失败率、移植物抗宿主病发生率较高,造血重建时间长。供者与受者ABO血型关系在生存状态、干细胞植入情况、造血重建时间、移植物抗宿主病的发生情况、感染发生情况方面差异无统计学意义。

关键词： 地中海贫血   线粒体   线粒体DNA突变  

摘要： 地中海贫血是一种常染色体隐形遗传病,线粒体DNA突变可能参与其中。多数临床研究显示地中海贫血可出现贫血,甚至死亡,严重程度与基因的缺失水平有关。积极进行输血及药物治疗是目前治疗地中海贫血的策略。本文就近年来线粒体DNA突变参与地中海贫血的发病机制进行综述,期望可为以后的地中海贫血研究提供新思路。

关键词： 贫血患者   缺铁性贫血   地中海贫血   网织红细胞血红蛋白含量   铁缺乏   数据显示   含量测定   临床资料  

摘要： 缺铁性贫血通常是由体内铁不足所导致。据WHO公布的数据显示,全球约66%~80%的人伴有铁缺乏状况[1]。本文探讨网织红细胞血红蛋白(Ret-He)含量测定在缺铁性贫血中的诊断价值,现报告如下。1对象与方法1.1研究对象收集2018年4月~2019年2月于我院就诊的138例贫血患者临床资料,包括51例缺铁性贫血患者:男34例、女17例,平均年龄(36.53±7.25)岁;42例肾性贫血患者:男23例、女19例,平均年龄(42.51±9.15)岁;45例地中海贫血患者:男26例、女19例,平均年龄(39.52±8.28)岁。