关键词:
沙利度胺
β地中海贫血
γ珠蛋白
红系分化
摘要:
目的:本研究探索沙利度胺对重型β地中海贫血患者以及体外红系细胞珠蛋白表达及分化的作用及相关调控机制。方法:首先以二阶段法体外培养红系细胞,沙利度胺为实验组、羟基脲为阳性对照、等体积溶剂二甲基亚砜(DMSO)为阴性对照组,分别作用于体外培养的重型β地中海贫血患者红系细胞。利用实时荧光定量PCR(q PCR)法检测珠蛋白基因及参与调控的转录因子的转录水平;蛋白免疫印迹法(WB)检测珠蛋白的表达水平;流式细胞仪检测各组细胞在分化不同阶段的成熟情况。其次,收集服用过沙利度胺药物的中重型β地中海贫血患者的不同时期骨髓液与外周血,分别检测其用药后不同临床指标的改变。结果:1.人红系细胞体外培养与分化体系本实验室体外红系分化培养体系,可以使CD34+定向分化为红系细胞。镜下观察细胞呈圆形或椭圆形,细胞胞质透亮,细胞直径随着分化天数的增加减小。分化第21天时,可见胞质边缘区透亮度增强,中心透亮度减低,形似双凹圆盘状,成熟红细胞。细胞数量在培养至第12天时达到最高,从6×10个最大可扩增为3×10个细胞,红系表面标记物CD235a最高可达92%±1.32%,去核率约为40%±5.12%。2.沙利度胺对重型β地中海贫血患者红系的珠蛋白表达的影响在最佳作用时间与浓度作用下(200μmol/L下作用72 h),沙利度胺组HBG m RNA在分化第7天开始升高,在红系细胞分化第14天时表达量高于对照组3倍(P<0.05),与阳性对照组无差异(P>0.05)。在分化21天时沙利度胺组HBG m RNA表达为对照组2倍(P<0.05)。而沙利度胺组对于HBA与HBB在分化过程中的表达无明显影响(P>0.05)。利用WB检测重型β地中海贫血患者红系γ珠蛋白在分化阶段的表达情况发现,沙利度胺组γ珠蛋白在分化第14天高表达,与q PCR结果显示一致。结果显示,沙利度胺可以在分化中不影响红系HBA、HBB转录水平的情况下,提升γ珠蛋白的转录和翻译水平,并且在分化第14天时提升最明显。3.沙利度胺对重型β地中海贫血患者体外培养红系分化的影响沙利度胺组红系表面分化标记物较DMSO组在分化后期有所降低(P<0.05),提示沙利度胺可能对红系分化产生抑制效果。4.参与重型β地中海贫血患者红系γ珠蛋白与分化调控基因的表达情况与DMSO组相比,沙利度胺组BCL11A的转录及翻译水平较DMSO组减少;ATF4在分化21天、HRI在分化第14、第21天表达下降(P<0.05);KLF1在分化第7、第21天表达下降(P<0.05);KLF2在分化中的表达与DMSO组比较,差异无统计学意义(P>0.05);GATA1表达量在分化第7、第21天下降(P<0.05);SOX6在分化第14、第21天表达下降(P<0.05);TAL1在分化第21天表达下降(P<0.05)。使用沙利度胺后,红系细胞内BCL11A下降,同时HRI、ATF4均为下降趋势,提示沙利度胺可能通过HRI、ATF4通路下调BCL11A。KLF1、GATA1、SOX6、TAL1的下调变化可能在沙利度胺提升红系细胞内γ珠蛋白的过程中发挥作用。5.患者服用沙利度胺前后对比患者用药后外周血血红蛋白水平与用药前相比,使用沙利度胺29天与85后,患者体内血红蛋白水平表达增高,具有统计学意义(P<0.05)。而组间比较结果显示,29天与85天较15天升高(P<0.05)。沙利度胺后,患者体内γ珠蛋白转录水平增高,具有统计学意义(P<0.05)。在用药15天、29天、85天时分别升高约为用药前的2.5倍、5倍、3倍。其中用药29天γ珠蛋白转录水平最高,用药15天与用药85天患者体内γ珠蛋白表达无差异。与用药前相比,使用沙利度胺后,患者体内α珠蛋白转录水平增高,具有统计学意义(P<0.05)。组间比较无差异。患者用药后体内β珠蛋白转录水平各组与用药前相比,无统计学差异(P>0.05),组间比较亦无统计学差异。与用药前相比(SF为5379.0253±3980.02656μg/L),用药后患者SF有下降趋势,SF为3819.5072±2786.48126μg/L,具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.本实验室改良的二阶段红系分化培养法扩增效率和分化效率较高,能更好的模拟体内环境。2.沙利度胺能提升体外培养重型β地中海贫血患者红系细胞γ珠蛋白转录及翻译水平。3.沙利度胺可能影响体外培养重型β地中海贫血患者红系细胞分化,在分化末期,沙利度胺可能通过下调SOX6与TAL1减缓红系的分化,增加未成熟红细胞的增殖,调节血红蛋白转录,从而有效诱导γ珠蛋白。***1A、KLF1、GATA1等转录因子可能参与沙利度胺调控γ珠蛋白表达的过程。HRI、ATF4通路可能参与沙利度胺调控BCLl1A的过程。5.在临床上,沙利度胺能提升中重型β地中海贫血患者