关键词： 非输血依赖型地中海贫血   脑梗死   高凝状态   铁超载   抗血小板  

摘要： 研究背景:地中海贫血是最常见的遗传性血红蛋白病之一。该病的特点是α或β基因缺陷,继而引起珠蛋白链生成减少或缺失,血红蛋白结构改变及合成不足。主要分为α地中海贫血及β地中海贫血,临床上根据输血依赖程度的不同,可分为输血依赖型地中海贫血和非输血依赖型地中海贫血(non-transfusion dependent thalassemia,NTDT)。NTDT是指不需要长期规律输血的地中海贫血类型。血栓性栓塞事件是地中海贫血的常见并发症,尤其多见于NTDT患者。然而,迄今为止,我们尚未检索到有关NTDT合并急性脑梗死的临床研究报道。 目的:1.分析NTDT合并急性脑梗死患者的临床资料,探寻NTDT合并急性脑梗死的临床特点;2.观察NTDT合并急性脑梗死患者抗血小板聚集药物的使用情况,为NTDT合并急性脑梗死患者的抗血小板聚集药物治疗的安全性及有效性提供参考。 方法:以2013年10月至2020年10月在广西医科大学第一附属医院因急性脑梗死住院的NTDT患者作为病例组(包括α地贫合并急性脑梗死组、β地贫合并急性脑梗死组两个亚组);以202例年龄、性别与病例组相匹配的非地中海贫血急性脑梗死患者作为对照组。收集所有患者的人口学资料、传统脑血管病危险因素、临床资料、脑梗死病因学分型(TAOST分型)、实验室检查、影像学资料、神经功能缺损评分量表及抗血小板聚集药物使用情况等。对所有的数据采用SPSS 26.0统计软件进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。 结果:病例组共纳入NTDT合并急性脑梗死患者21例(包括6例α地中海贫血、15例β地中海贫血),对照组纳入非地中海贫血急性脑梗死患者202例。 1.病例组体重指数、血红蛋白、糖化血红蛋白、载脂蛋白A1、碱性磷酸酶水平显著低于对照组,住院天数、血清铁蛋白、超敏C反应蛋白、血沉、凝血酶原时间显著高于对照组。病例组的D-二聚体与对照组相比,差异无统计学意义。但进一步亚组分析显示,β地中海贫血组的D-二聚体显著高于对照组[353(151,2297)VS.293.5(20.75,937.25),p=0.049]。 2.病例组脑梗死TOAST分型以小动脉闭塞型为主,显著高于对照组(66.7%VS.33.7%,p=0.021)。 3.病例组的住院天数显著高于对照组(P=0.001)。 4.病例组与对照组抗血小板聚集药物治疗后的NIHSS及m RS评分对比,差异无统计学意义(P>0.05);病例组抗血小板治疗前后血小板计数、平均血小板体积对比,差异均无显著差异(P>0.05)。对照组抗血小板聚集药物治疗前后平均血小板分布宽度显著下降(P<0.001),但平均血小板体积显著增加(P=0.002);病例组及对照组出血事件发生率及抗血小板治疗后复查血红蛋白前后对比,差异无统计学意义。 结论:1.非输血依赖型β地中海贫血合并急性脑梗死患者的D-二聚体水平显著高于非地中海贫血的急性脑梗死患者,这提示非输血依赖型β地中海贫血合并急性脑梗死患者血液可能存在高凝状态。2.合并NTDT的急性脑梗死患者TOAST分型以小动脉闭塞型为主。***合并急性脑梗死患者抗血小板治疗短期内未见明显不良事件发生,有效性待进一步研究。

关键词： 非输血依赖型地中海贫血   急性脑梗死   危险因素   预后  

摘要： 目的:通过对地中海贫血(Thalassemia)发生急性脑梗死(Acute cerebral infarction)患者的血清学、影像学、预后特点进行分析,探索其发生脑梗死的危险因素及影响短期预后的不良因素。 材料与方法:根据筛选标准,连续性收录2013年1月至2021年12月在广西医科大学第一附属医院住院治疗的非输血依赖型地中海贫血合并急性脑梗死患者51例,同时收录同期住院治疗的相同性别、相近年龄未合并地中海贫血的单纯脑梗死患者51例及相同性别、相近年龄的单纯地贫患者51例,非输血依赖型地中海贫血合并无症状脑梗死患者27例,分别设置为联合组、单纯脑梗组、单纯地贫组和无症状脑梗组。根据出院时(住院时间超过30天患者按第30天的评分)m RS评分把非输血依赖型地中海贫血合并急性脑梗死患者分为预后良好组36例及预后不良组15例。依据影像学病灶单发或多发把非输血依赖型地中海贫血合并急性脑梗死患者分为病灶单发组和病灶多发组。回顾性分析它们的临床资料。 结果:1.一般情况:非输血依赖型地中海贫血患者以老年人多见,男女比例基本相当,起病症状以运动障碍为主,其次为言语功能障碍,吞咽困难、饮水呛咳症状较单纯脑梗组常见(P>0.05)。在非输血依赖型地中海贫血合并症状性脑梗死及无症状脑梗死的临床资料分析中,两者在糖尿病史方面差异具有统计学意义,提示患糖尿病的地中海贫血患者更容易出现症状性脑梗死。 2.血清学特点:联合组以中度贫血为主(56.86%),其次是轻度贫血(33.33%),在血红蛋白水平方面与单纯地贫组的分布基本相当。对比单纯脑梗死患者,地贫患者(联合组及单纯地贫组)D-二聚体及纤维蛋白原较高。 3.影像学特点:非输血依赖型地中海贫血患者病灶以多发为主(82.4%),尤其是在症状性脑梗死中。病灶主要分布于放射冠、半卵圆中心(57.1%),其次为丘脑、基底节区(41.8%),再次为脑干(22.4%)。病灶单发组和多发组在血红蛋白、白蛋白、心率方面具有差异,speaman相关分析显示病灶是否多发与红细胞、血红蛋白、白蛋白水平存在正相关性。 4.危险因素:联合组在白细胞计数、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白方面较单纯地贫组更高,将其纳入二元logistic回归分析模型中进行多因素分析。结果显示白细胞计数升高(0R=1.206,95%CI:1.032-1.410,p=0.018)是地中海贫血患者发生急性脑梗死的危险因素。 5.预后评估:非输血依赖型地中海贫血合并脑梗死患者神经功能损害程度整体较低,入院NIHSS评分是评估短期预后的影响因素,入院NIHSS评分越低,预后越好。 结论:1.地贫合并脑梗死好发于老年患者,起病症状以运动障碍为主,其次为言语功能障碍,吞咽困难、饮水呛咳症状较单纯脑梗组常见。影像学呈现病灶多发的特点,病灶多发与红细胞、血红蛋白、白蛋白水平存在正相关性。 2.地贫合并脑梗死患者D-二聚体、纤维蛋白原均比单纯脑梗组更高,说明地贫合并脑梗死患者存在血液的高凝状态。 3.地贫合并脑梗死患者的神经功能损害整体较轻,短期预后相对较好,入院NIHSS评分是影响预后的因素。

关键词： 葡萄糖磷酸异构酶缺乏症   GPI基因   溶血性贫血   地中海贫血   α-珠蛋白基因   拷贝数变异  

摘要： 遗传性溶血性贫血（HHA,hereditary hemolytic anemia）是一组由于编码红细胞膜蛋白、红细胞酶或血红蛋白的基因发生变异导致的遗传性疾病,以红细胞寿命缩短为特征,临床表现以溶血和溶血性贫血为主,严重程度不一。在遗传性溶血性贫血中,地中海贫血是一种较常见的血红蛋白病,葡萄糖磷酸异构酶（GPI,glucosephosphate isomerase）缺乏症是较罕见的糖酵解代谢途径中的红细胞酶缺陷。本研究分为两部分,分别对一例罕见的葡萄糖磷酸异构酶缺乏症家系和两例地中海贫血家系进行了致病基因的鉴定和遗传学研究,完善了这两种遗传性溶血性贫血的基因突变谱,为遗传性溶血性贫血的诊断提供了新的经验和思路。第一部分一例葡萄糖磷酸异构酶缺乏症家系致病基因的鉴定背景:葡萄糖磷酸异构酶（GPI）缺乏症是一种罕见的红细胞酶缺陷病,由编码葡萄糖磷酸异构酶的GPI基因突变导致,以常染色体隐性模式遗传。临床表现主要为慢性非球形溶血性贫血,少数患者伴有神经肌肉症状。本病因其罕见和症状的非典型而难以确诊。本研究纠正了一例误诊为地中海贫血的GPI缺乏症患者,并进行了进一步的基因分析和诊断。方法:采集家系成员外周血,通过血液学表型分析、地中海贫血相关突变分析、全外显子测序和致病位点筛选、Sanger测序验证等对家系进行遗传分析。随后结合突变位点生物信息预测、家系成员病史及临床表型分析和相关实验进行确诊。此外,对GPI缺乏症相关文献进行了汇总。结果:先证者携带两个未被报道过的GPI基因突变,c.1207C>T和c.1255G>C,分别遗传自父亲和母亲,另携带一个地中海贫血突变HBB:c.126129delCTTT,遗传自其父亲。先证者和母亲的红细胞GPI酶活性均有不同程度降低,结合临床表型和基因型等,确定先证者为GPI缺乏症。随后,通过文献查找汇总了被报道的已经过基因型验证的GPI缺乏症患者,并绘制了 GPI基因突变谱。结论:本研究描述了一名罕见的GPI缺乏症患者的临床特征和诊断过程,纠正了其“地中海贫血的误诊”。发现了两个GPI基因的新突变,丰富了 GPI基因的突变谱。在地中海流行区域发生的罕见HHA因临床表型的相似性更易被考虑为地贫而发生误诊,准确的诊断有赖于更全面的病因认知和考虑。第二部分 两个α-珠蛋白基因拷贝数变异导致地中海贫血的家系鉴定背景:地中海贫血是一种常见的遗传性血液疾病,由调节球蛋白合成的基因突变或丢失引起。遗传原因之一是α-珠蛋白基因簇的拷贝数变异（CNVs,copy-number variations）。然而,对这些CNVs的详细信息和机制还没有统一的总结和讨论。本研究在两个诊断为地中海贫血的中国家庭中发现了两个新的CNVs。方法:采集家系成员外周血,通过血液学分析、地中海贫血常规基因检测、多重连接依赖探针扩增（MLPA,multiplex ligation dependent probe amplification）、下一代测序（NGS,next-generation sequencing）等方法对这两个家系进行分析。此外,对所有已知涉及α-珠蛋白基因的CNVs进行了总结,并对这些CNVs的产生机制进行了分析和预测。结果:在2例β-地中海贫血和Hb Bart's胎儿水肿综合征患者中分别发现了两个α-珠蛋白基因簇的新CNVs,一个重复（αααα159）和一个缺失（--259）。通过文献复习,筛选出了 42个α-珠蛋白基因的CNVs进行分析。基于突变断点区域不同的分子特征,我们认为这些CNVs的发生可能归因于几种机制。结论:本研究描述了两个涉及α-珠蛋白基因的新CNVs,为珠蛋白基因的变异谱增加了新内容。此外,对这些CNVs产生机制的探索为地中海贫血的分子病因学提供了一个机制视角。

关键词： β-地中海贫血   髓鞘   中枢神经系统   少突胶质细胞  

摘要： 背景:β-地中海贫血(β-地贫)是世界上常见的一种遗传性血红蛋白病,因其最早见于地中海沿岸地区而得名,在中国多发于南部地区。除了贫血,其引起的并发症也不容忽视,地中海贫血患者的并发症除了会降低患者的生活质量更甚者会导致残疾。β-地贫的核心病理是无效红细胞生成、铁过载、慢性溶血及氧化应激,且在这些病理中还存在着恶性循环。中枢神经系统疾病的病因多种多样,现有研究发现许多中枢神经系统疾病都伴有铁过载和氧化应激的特征。有研究表明中枢神经系统、血液供应、组织氧输送三者间存在着密切联系,已有多项研究报道β-地贫患者的中枢神经系统受累。因此,我们认为β-地贫可能对中枢神经系统有所影响。髓鞘在中枢神经系统中扮演着极为重要的角色,除了加快传导速度以外,还影响着神经元营养物质的供给。髓鞘的可塑性也参与多种认知活动,当髓鞘发生缺陷时,会导致认知功能的异常和其他中枢神经系统疾病。随着β-地贫患者的预期寿命逐渐增加,其神经系统并发症也逐渐开始显现,目前,对β-地贫与中枢神经系统之间关联的研究还极为缺乏,因此研究地中海贫血患者中枢神经系统可能存在相关的病变是有意义的。此研究可为临床诊断β-地贫患者的神经系统相关并发症提供基础依据,并且可以加深对髓鞘形成的调控机制的理解,为髓鞘相关疾病发病机制的探索以及治疗方案的研究提供助力。目的:(1)探究β-地贫对小鼠髓鞘形成和少突胶质细胞的影响;(2)探寻β-地贫影响中枢神经系统髓鞘形成的机制。方法:(1)研究对象分为两组:野生型小鼠和β-地贫小鼠,分别于出生后第7天、14天、21天、3个月对两组小鼠进行称重及组织取材,比较血液学指标、脾脏和脑组织的形态、脾重比等的差异,以检测β-地贫小鼠模型的可靠性。(2)取出生后第14天、21天、3个月小鼠的脑组织及脊髓组织,蔗糖脱水后进行冷冻包埋、切片,采用免疫荧光(MBP)的实验方法检测小鼠中枢神经系统髓鞘发育的变化,采用免疫荧光(Olig2+CC1)的实验方法检测小鼠的少突胶质谱系细胞及成熟的少突胶质细胞的发育变化,以探究β-地贫对小鼠髓鞘形成和少突胶质细胞的影响。(3)提取小鼠脑组织蛋白,灌流取材后液氮速冻并放入-80℃冰箱保存。通过转录组测序的方法筛选差异基因,并进行差异基因的通路富集分析等,以探究β-地贫影响中枢神经系统髓鞘发育的机制。结果:(1)14和21日龄的β-地贫小鼠的体重都显著低于对照小鼠,其他时间点体重无差异。β-地贫小鼠的脑组织在第14天、第21天时小于对照小鼠。7日龄的β-地贫小鼠的脾重比与对照小鼠无差别,14日龄、21日龄和3月龄β-地贫小鼠的脾和脾重比都显著大于对照小鼠。第14天时小鼠的血红蛋白含量组间无显著差异,但β-地贫小鼠红细胞数、红细胞压积均显著降低。第14天后的各时间点的β-地贫小鼠均存在红细胞数、血红蛋白含量、红细胞压积的显著降低。并且在各时间点都出现了红细胞分布宽度变异系数和白细胞数的显著升高。(2)β-地贫小鼠在第14天时胼胝体、大脑皮层和脊髓背部的髓鞘均明显少于对照小鼠,在第21天和第3个月时无差异。14日龄的β-地贫小鼠胼胝体的Olig2阳性细胞(少突胶质细胞)数量减少,脊髓背侧和大脑皮层中少突胶质细胞数量语对照组相比无差异。在14日龄β-地贫小鼠的脊髓背侧、胼胝体、大脑皮层中共表达CC1和Olig2的细胞(成熟的少突胶质细胞)均减少。21日龄和3月龄的β-地贫小鼠的脊髓背侧、胼胝体、大脑皮层中Olig2阳性细胞和共表达CC1+Olig2细胞的数目均与对照无差异。(3)通过转录组测序筛选出了21日龄β-地贫小鼠和对照小组的脑组织中的98个差异基因,颈段脊髓中的30个差异基因。通过GO富集分析,脑组织差异基因富集在286条GO功能中,颈段脊髓组织差异基因富集在520条GO功能中,并且均主要富集在生物学过程中。KEGG富集分析显示脑组织中的差异基因主要富集在6个通路,如神经活性配体-受体相互作用等;颈段脊髓的差异基因主要富集在5个通路中,如PI3K-Akt信号通路等。结论:(1)β-地贫影响小鼠发育过程中的体重及脑形态等,上述二者在成熟后差异消失。β-地贫小鼠除了在红细胞参数上符合贫血特征,还表现出了白细胞计数的增高。该模型可以在一定程度上模拟β-地贫患者的情况。(2)β-地贫影响中枢神经系统中髓鞘的早期发育,在各部位均表现出成熟的少突胶质细胞水平的降低,但少突胶质细胞谱系细胞的差异并不一致,说明各个部位中影响髓鞘生成的机制不同。早期存在的滞缓现象,包括髓鞘和少突胶质细胞水平,均在后期得到恢复。(3)21日龄小鼠脑组织和脊髓组织的转录组测序的差异基因GO及富集的通路上没有发现与髓鞘发育相关的通路的变化,但发现了部分差异基因如Gal、Hcrt、TRPM3、AGT等,或许与β-地贫小鼠的髓鞘形态在21天时恢复至正常水平有关,或可作为促髓

关键词： 重型β地中海贫血   产前诊断   预防控制   质性研究   病例对照   影响因素  

摘要： 目的:本研究采用半结构式深入访谈和病例对照调查相结合,回顾性分析重型β地中海贫血(Beta-Thalassemia Major,β-TM)患儿出生情况及相关影响因素,旨在为预防和控制桂西地区重型地中海贫血患儿出生制订更为有效的防控计划提供理论依据。方法:(1)第一部分:采用质性研究法,选取2019～2020年百色市终止妊娠和延续妊娠的β-TM胎儿夫妇共14例(终止妊娠6例,延续妊娠8例)作为研究对象进行半结构试访谈,运用Colaizzi七步分析法进行资料整理分析,探究β-TM患儿出生及预防无效的原因。(2)第二部分:采用病例对照研究,根据纳入与排除标准,将2015～2020年期间百色市出生的β-TM患儿父母纳入病例组(n=60),同期在百色市确诊并引产的β-TM胎儿夫妇纳入对照组(n=80)。通过发放纸质调查表和桂妇儿系统收集研究对象的基本信息(一般人口学资料、孕产史、地中海贫血筛查情况和疾病知晓度情况)。数据分析采用SPSS 25.0,对病例组与对照组的一般资料做描述性分析,以妊娠结局为因变量对β-TM患儿出生影响因素的研究进行单因素和多因素Logistic回归分析,α=0.05为检验标准。结果:(1)质性研究结果析出4个主题:(1)疾病认知个体间存在差异性;(2)生育意愿强烈;(3)产前诊断依从性差;(4)专业医务人员干预力度及水平参差不齐。(2)调查对象的基本特征:本次调查病例组共纳入60例β-TM患儿父母,其中生育男孩34例,女孩26例,平均年龄(4.51±1.57)岁;患儿父亲平均年龄(31.13±6.09)岁,患儿母亲平均年龄(28.00±5.65)岁。对照组共纳入80例引产夫妇,其中产妇平均年龄(30.13±5.45)岁,丈夫平均年龄(31.91±5.97)岁;产前诊断(Prenatal Diagnosis,PND)检查集中在14～25w孕中期;平均引产孕周(22.80±3.79)周。(3)β-TM患儿出生前,父母地中海贫血知晓度情况较差,缺乏疾病认知。(4)单因素Logistic回归分析结果显示:居住地区、母亲年龄、父母文化程度、产次、地中海贫血家族史以及地中海贫血基因诊断是β-TM患儿出生的影响因素(P<0.05)。(5)多因素Logistic回归分析结果显示:父母居住地区在农村的β-TM患儿出生风险高于城镇(OR=0.091,95%CI:0.017-0.472);母亲年龄<24岁的β-TM患儿出生风险高于年龄≥24岁(OR=0.137,95%CI:0.024-0.786);相比母亲文化程度为小学及以下,文化程度为初高中(OR=0.063,95%CI:0.009-0.432)是β-TM患儿出生的保护因素;此外经产(OR=0.144,95%CI:0.028-0.735)、有地中海贫血家族史(OR=0.130,95%CI:0.031-0.533)、进行地中海贫血基因检测(OR=0.014,95%CI:0.002-0.092)会降低β-TM患儿出生的风险。结论:(1)个体对疾病认知存在差异、生育意愿强烈、产前诊断依从性差和和专业医务人员干预力度及水平较低会导致β-TM胎儿出生。(2)β-TM患儿出生前父母缺乏疾病认知,产前诊断依从性差。(3)β-TM胎儿出生风险受多种因素的影响,父母居住地为农村、产妇年龄<24岁是β-TM出生的危险因素,而产妇受教育程度高、经产、有地中海贫血家族史及进行过地中海贫血基因检测是β-TM出生的保护因素。提示需要重点关注偏远地区、早婚早孕及文化程度较低的孕妇孕期进行产前诊断,并加强追踪随访。

关键词： β-地中海贫血   遗传修饰   胎儿血红蛋白   核苷酸多态性  

摘要： 【目的】胎儿血红蛋白（Hb F）含量增加可改善β-地中海贫血患者的临床贫血症状。本研究对HBG1基因的rs368698783（G>A）多态性位点和HBG2基因的rs7482144（C>T）多态性位点与Hb F表达进行关联分析,分析这两个位点与Hb F表达之间的关系;对β-地中海贫血患者中参与调控Hb F表达水平的遗传修饰基因多态性位点进行研究,分析各修饰基因位点多态性与Hb F表达的相关性,探讨这些突变位点对缓解β-地中海贫血患者临床贫血症状的影响。【方法】（1）通过地中海贫血基因检测收集β-地中海贫血纯合子样本（β0/β0,β+/β+）、β-地中海贫血复合杂合子样本（β0/β+）、Hb E/β-地中海贫血样本（βE/β0,βE/β+）,总计51例;Hb E纯合子样本（βE/βE）40例;通过血红蛋白电泳检测收集Hb F>5%样本,根据地中海贫血基因检测结果分为Hb F>5%（βN/βN）样本113例和Hb F>5%（βM/βN）样本113例;将血红蛋白电泳及地中海贫血基因检测结果为正常的无亲缘关系样本262例作为对照组。对收集的样本进行基因组DNA提取,使用sanger测序法对rs368698783及rs7482144位点进行基因型鉴定,比较各组的血液学参数、突变基因检出率和最小等位基因频率,分析该多态性位点与Hb F水平之间的关系;选取部分样本进行RNA提取,对γ-珠蛋白转录本进行Gγ/Aγm RNA表达含量的分析,分析rs368698783位点与rs7482144位点连锁和不连锁带来的功能影响。（2）通过地中海贫血基因检测收集76例β-地中海贫血患者样本并进行基因组DNA提取。针对参与调控Hb F表达的修饰基因定制基因芯片,设计基因panel,运用高通量测序技术对相关修饰基因进行检测。对测序结果变异位点信息进行全基因组关联分析,比较Hb F表达水平在不同β-地中海贫血个体之间存在的多态性,分析突变位点多态性与Hb F表达的相关性。【结果】（1）非输血依赖型β-地中海贫血患者的rs368698783与rs7482144位点的突变等位基因检出率较正常对照组有显著性差异（P<0.05）,而输血依赖型β-地中海贫血患者无显著差异（P>0.05）;输血依赖型β-地中海贫血患者与非输血依赖型β-地中海贫血患者相比突变等位基因检出率有显著性差异（P<0.05）。Hb E/β-地中海贫血患者和Hb E纯合子样本的rs368698783与rs7482144位点突变检出率与对照组相比有显著性差异（P<0.05）,而β-地中海贫血患者与对照组相比无显著差异（P>0.05）。（2）Hb F>5%（βN/βN）、Hb F>5%（βM/βN）样本与对照组rs368698783与rs7482144位点突变检出率相比均有显著性差异（P<0.05）。β地贫患者各组间SNPs位点多态性与Hb F水平的关系不明显。（3）rs368698783突变等位基因使Gγ/Aγm RNA表达的比值升高（P<0.05）,存在1例rs368698783为野生型而rs7482144为杂合型样本,Gγ/Aγm RNA比值位于rs368698783野生型范围内,表明rs368698783修饰效应强于rs7482144位点。（4）对76例β-地中海贫血患者进行NGS检测参与调控Hb F表达的基因,我们的研究已经确定了不同类型的多态性,共检出17072种突变,包括SNPs、insertions、deletions、indels等结构变异。共检出135个与Hb F水平相关的突变位点（P<0.05）,其中在2、6、9、11、14、15、16、19号染色体上检出15种与Hb F的表达相关程度更高（P<0.001）。包括2个错义突变、2个同义突变、1个3’UTR区突变、8个内含子区突变和2个基因间区突变。【结论】（1）rs368698783与rs7482144位点多态性与Hb F水平升高有关,并且与Hb E突变存在相关性,rs368698783的A等位基因与rs7482144位点的T等位基因可以减轻β-地中海贫血的贫血程度,缓解β-地中海贫血的临床贫血症状,rs368698783位点相比于rs7482144位点对β-地中海贫血的修饰效应更强。（2）β-地中海贫血患者中发现15个SNPs多态性位点与高Hb F水平相关,进一步证实并丰富了地中海贫血的遗传修饰位点,为阐明地中海贫血的分子病理机制、筛选药物靶点和制定诊疗方案提供实验依据和理论基础。

关键词： 地中海贫血   造血干细胞移植   HLA亲缘全相合   HLA非亲缘全相合   新鲜脐血移植   儿童血液病  

摘要： 研究背景地中海贫血是一种常染色体隐性遗传病,目前有输血、祛铁,造血干细胞移植和基因治疗等治疗方法,其中造血干细胞移植是最成熟的治愈方法。临床上进行移植治疗会首先考虑寻找HLA全相合的供者,在HLA全相合的情况下,不同的干细胞来源及移植物仍会导致不同的移植效果。目的比较HLA全合亲缘移植与HLA全合非亲缘移植治疗地贫效果;探讨在亲缘HLA全相合的前提下,进行不同移植物的地贫移植,存活率、无病生存率是否存在明显差异;探讨同胞全相合新鲜脐血移植在治疗地贫方面是否存在一定的优势。方法收集南方医院儿科2009-2020年间所有亲缘及非亲缘HLA全相合地贫移植的相关病例资料,以及2009-2020年间所有亲缘HLA全相合地贫移植的相关病例资料,进行回顾性分析。随访截止时间为2021年12月31日。统计各移植方式移植前患者、供者的移植相关特征,预处理、预防GVHD药物的差异,以及移植后的存活率、无病生存率、疾病相关死亡率、植入情况、移植后感染情况、VOD、GVHD及其它并发症发生情况,对各移植方式进行比较。结果共纳入474例重型β地贫患者。在亲缘及非亲缘HLA全相合地贫移植的比较组中,亲缘HLA全相合移植有154例,非亲缘HLA全相合移植有213例,且均为外周干来源,中位随访时间31个月,中位植入随访时间31个月。在亲缘HLA全相合地贫移植比较组中,新鲜脐血移植为43例、骨髓移植为18例、外周干移植为154例、冷冻脐血+骨髓移植为23例、冷冻脐血+外周干移植为22例,中位随访时间33个月,中位植入随访时间33个月。(1)本中心亲缘HLA全相合移植和非亲缘HLA全相合移植的OS和EFS分别为95.9±1.7%和95.2±1.5%(P=0.71)、95.9±1.7%和 93.8± 1.7%(P=0.34),均无明显差异;亲缘HLA全相合移植的TRM为3.9%,非亲缘HLA全相合移植的TRM为4.7%。(2)亲缘HLA全相合移植和非亲缘HLA全相合移植的植入情况、三系植入时间无明显差异,但非亲缘组较亲缘组的血小板植入情况差(P=0.007)。(3)亲缘HLA全相合移植和非亲缘HLA全相合移植在移植期间的感染情况无明显差异,VOD的发生也无明显差异;但在移植后,非亲缘移植组更容易出现泌尿系统(P=0.005)及耳鼻喉(P=0.02)的并发症。移植后非亲缘移植组更易出现CMV(P=0.047)和多瘤病毒的感染(P=0.003)。(4)移植后1年内出现感染的细菌种类以革兰阳性杆菌和革兰阳性球菌为主。(5)非亲缘移植组较亲缘移植组更容易出现GVHD的发生(P<0.001),无论是急性GVHD(P<0.001)还是慢性GVHD(P=0.007),发生部位在皮肤的情况多(分别为P<0.001和P=0.02)。(6)移植后亲缘HLA全相合移植和非亲缘HLA全相合移植的血清铁蛋白变化情况无明显差异。(7)在亲缘HLA全相合移植中,新鲜脐血移植与其它移植方式相比,其OS更高,EFS更低,但无明显统计学意义。(8)新鲜脐血移植的三系植入时间比其他移植组更长并具有统计学意义,且三系植入情况比外周干移植差(P<0.001、P<0.001、P<0.001)。(9)新鲜脐血移植组移植后感染情况和其他移植组相比并无明显优势,VOD发生情况无明显差异。(10)新鲜脐血移植的GVHD的发生率、急慢性GVHD比例、急性GVHD的严重程度均较其它移植方式更低,但无明显统计学意义。结论HLA全相合亲缘与非亲缘地贫移植的OS和EFS无明显差异,但非亲缘移植的急/慢性GVHD发生率明显更高,且两者均以发生在皮肤为多。亲缘HLA全相合移植中,新鲜脐血移植较其它移植方式并无明显优势。

关键词： β-地中海贫血   基因突变类型   罕见突变   血液学特征  

摘要： 目的:分析174例β-地中海贫血杂合子病例,了解地中海贫血突变类型情况和临床特征,探讨单纯β-地中海贫血杂合子和β-地中海贫血杂合子复合α-地中海贫血病例在血液学特征上的差异,分析罕见β-珠蛋白基因突变导致β-地中海贫血的血液学特征。方法:研究对象来源于2021年1月至2021年12月在广西医科大学第一附属医院进行地中海贫血诊疗的病例。通过血常规和血红蛋白分析进行地中海贫血筛查,通过Gap-PCR方法、荧光PCR熔解曲线法和DNA测序进行α-和β-地中海贫血基因分析。应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。结果:1.一般资料:在诊疗病例中检出174例β-地中海贫血杂合子病例,男性75例,女性99例,年龄介于7个月至99岁。2.基因分析结果:（1）β-地中海贫血基因分析结果共检出174例β-地中海贫血杂合子病例,包含14种β-珠蛋白基因突变类型,其中2种为罕见β-珠蛋白基因突变,分别为1例CD114（CTG>CCG,HBB:c.344T>C）突变杂合子和1例CD121（GAA>TAA,HBB:c.364G>T）突变杂合子。及12种其他β-珠蛋白基因突变杂合子,分别为69例CD41-42（-TTCT）/N,61例CD17（A>T）/N,14例IVS-Ⅱ-654（C>T）/N,8例CD71-72（+A）/N,8例-28（A>G）/N,3例CD26（G>A）/N,3例CD27-28（+C）/N,2例IV S-Ⅰ-1（G>T）/N,1例CD43（G>T）/N,1例IVS-Ⅱ-5（G>C）/N,1例-29（A>G）/N,1例-90（C>T）/N。本研究检出的14种β-地中海贫血基因突变类型中,基因频率较高的突变为CD41-42（-TTCT）、CD17（A>T）、IVS-Ⅱ-654（C>T）和CD71-72（+A）突变,对应等位基因频率分别为39.6%、35.0%、8.1%和4.6%。（2）α-地中海贫血基因分析结果174例β-地中海贫血杂合子病例中,140例未检出α-地中海贫血基因突变,34例检出合并α-地中海贫血基因突变。涉及的α-地中海贫血基因型有5种,分别为--/αα、-α/αα、-α/αα、αα/αα和αα/αα,包括12例合并--/αα,9例合并-α/αα,4例合并-α/αα,6例合并αα/αα,3例合并αα/αα。3.血常规结果:（1）2例罕见β-地中海贫血杂合子病例血常规结果:CD114（CTG>CC G）杂合子病例血常规结果为:RBC 3.65×10/L,Hb 78.3 g/L、MCV 66.52 f L,MCH 21.48pg,MCHC 322.9g/L,HCT 0.243 L/L;CD121（GAA>T AA）杂合子病例血常规结果为:RBC 4.86×10/L,Hb 100.1g/L,MCV 64.04f L,MCH 20.62pg,HCT 0.311 L/L。（2）174例β-地中海贫血杂合子病例血常规结果:其中140例单纯β-地中海贫血杂合子血常规结果为:RBC 3.65～7.34×10/L,Hb 76.3～153g/L,MCV 55.95～82.5f L,MCH 16.13～28.1pg,MCHC 273.9～341g/L,HCT0.24～0.49L/L;34例β-地中海贫血合并α-地中海贫血病例血常规结果:RB C 4.14～7.16×10/L,Hb 82.0～147.0g/L,MCV 56.48～85.68f L,MCH 17.38～27.19pg,MCHC 299.1～338.0g/L,HCT 0.26～0.46L/L。（3）比较单纯β-地中海贫血杂合子病例组和β-地中海贫血复合α-地中海贫血病例组的血常规结果,发现单纯β-地中海贫血杂合子组MCV、MCH较β-地中海贫血复合α-地中海贫血组低,差异有统计学意义（P<0.05）。4.血红蛋白分析结果:（1）2例罕见β-地中海贫血病杂合子病例血红蛋白分析结果:CD114（CTG>CCG）杂合子病例血红蛋白分析结果为:Hb A4.4%,Hb F 2.6%;CD121（GAA>TAA）杂合子病例血红蛋白分析结果为:Hb A 3.9%,Hb F1.2%。（2）174例β-地中海贫血杂合子病例血红蛋白分析结果:其中140例单纯β-地中海贫杂合子血红蛋白分析结果:Hb A3.5～26.5%,Hb F 0.4～8.3%;34例β-地中海贫血合并α-地中海贫血复合杂合子:Hb A 4.50～7.70%,Hb F 0.40～3.7%。（3）比较单纯β-地中海贫血杂合子突变病例组和β-地中海贫血复合α-地中海贫血病例组血红蛋白分析结果,两组之间Hb A、Hb F差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.首次在国内发现罕见β-珠蛋白基因CD114（CTG>CCG）突变导致β-

关键词： ATRX   α-地中海贫血   智力障碍   新发突变   全外显子组测序  

摘要： 背景与目的:X连锁α-地中海贫血/精神发育迟滞综合征（Alpha-Thalassemia X-Linked Intellectual Disability Syndrome,OMIM301040）又称ATR-X综合,是一种罕见的X连锁显性遗传性综合征。ATR-X综合征患者具有特征性临床表现,临床特征主要包括:中重度智力发育障碍,生长发育迟缓,癫痫发作,特征性面容,常伴有胃肠功能障碍,部分患者伴有α-地中海贫血。ATRX基因突变导致ATR-X综合征,定位于Xq21.1。ATRX蛋白属于染色质重塑蛋白的SWI/SNF家族,是染色质重塑因子,包含一个与DNA结合的锌指结构域和一个解旋酶结构域,参与广泛的生物学功能:转录调控,DNA修复和染色体分离。ATRX蛋白是一种异染色质相互作用蛋白,与其相互作用的蛋白有MeCP2、HP1和DAXX,ATRX基因的异常表达,影响蛋白的相互作用,导致智力发育障碍。目前已有127种ATRX基因突变被报道,包括无义突变、缺失、插入、剪接突变。本文针对一个ATR-X综合征家系,通过全外显子组测序（whole exome sequencing,WES）结合Sanger验证查找致病位点,对致病基因突变进行功能研究,为该家系的临床精准诊断和遗传咨询提供依据。材料和方法:1.研究对象:收集一个ATR-X综合征家系,共两代人,先证者为男性,5岁8月,临床表现符合该综合征特征。2.实验方法:收集家系信息,对家系成员进行临床检验及ATRX突变基因功能分析实验。临床检验包括以下项目:血常规、血红蛋白电泳、性激素和生长激素。ATRX突变基因功能分析实验:WES,Sanger验证,逆转录及实时荧光定量多聚酶链式反应（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR）,qRT-PCR产物测序,蛋白印迹实验（Westernblot）。3.生物信息学分析:使用Mutation Taster对突变位点的致病性进行预测,LUMC Mutalyzer3对氨基酸序列改变进行预测,I-TASSER预测ATRX蛋白变异后的结构,MaxEntScan进行剪接位点有害性预测。结果:先证者临床表现为严重智力障碍、体格发育迟缓,特殊面容、双侧隐睾等多发先天异常。临床检验结果提示先证者存在红细胞平均体积下降,睾酮值降低,WES发现ATRX基因第3、4外显子剪接供点插入突变（NM000489:c.189+1dupG）。Sanger测序验证突变遗传自携带杂合突变的母亲,父亲未携带该突变。mRNA水平验证表明,该变异可导致ATRX基因转录产物下降（P<0.05）。qRT-PCR产物Sanger测序提示先证者cDNA第189位与第190位碱基之间插入碱基G,导致异常剪切,编码至第65位氨基酸提前终止翻译,形成一个截短蛋白。在线软件预测,变异所在剪接区核苷酸高度保守,有害性预测结果显示为有害。结论:该家系中发现了一个ATRX基因新的突变,功能研究显示该突变是导致该家系呈现ATR-X综合征的致病原因。本研究拓展了 ATRX基因的突变谱,并为该家系的临床确诊和遗传咨询提供了依据。

关键词： 重型β-地中海贫血   终末期红细胞   全基因组DNA甲基化测序   单细胞转录组测序  

摘要： 目的和意义:β-地中海贫血主要由于β-珠蛋白基因发生突变导致正常β-珠蛋白链合成减少或缺乏,多余的α-珠蛋白沉积在红细胞膜上,造成红细胞损坏及髓内无效造血。重型β-地中海贫血患者因贫血、长期输血导致的并发症使多数患儿夭折,目前具临床治愈效果的异基因造血干细胞移植(Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)受限于供者来源、移植相关并发症等问题。因此基因编辑治疗应运而生。本课题利用全基因组DNA甲基化测序及单细胞转录组测序技术,对重型β-地中海贫血患者移植前与移植后以及健康供者进行差异DNA甲基化及差异转录组分析,旨在为研究地中海贫血疾病的红细胞分化进程的分子机制提供基因靶点。 方法: 1、收集33例因重型β-地中海贫血行HSCT患者外周血,分析其移植后2周、1个月、2个月、3个月和6个月的血红蛋白含量、珠蛋白基因以及红细胞特异性相关基因的表达变化。 2、收集2例重型β-地中海贫血患者移植前、移植后1个月及2例相关供者骨髓样本,以目前存在的体外分化方法培养足够数量的人红系细胞,再利用全基因组DNA甲基化测序及单细胞转录组测序对其进行研究。 3、对骨髓来源的红系细胞进行全基因组DNA甲基化测序研究,比较重型β-地中海贫血疾病状态与移植后及供者的甲基化水平差异,使用生物信息学方法分析不同组间差异甲基化区域(Differentially methylated regions,DMRs)、DMRs转录因子结合基序以及DMRs相关基因GO功能。 4、对骨髓来源的红系细胞进行单细胞转录组测序研究,使用10×Genomics平台对终末期红细胞进行文库构建及测序。利用Monocle重建细胞分化轨迹,同时结合已报道的终末期红细胞特征表达基因数据,对终末期红细胞各阶段细胞进行注释。分析基因在不同组样本间在分化过程中表达水平的变化趋势差异。最后对DMR相关基因(DMGs)和差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)进行联合分析。 结果: 1、重型β-地中海贫血患者在移植后6个月内,存在造血恢复波动,通常在移植第6个月时恢复至供者水平。以供者作为参照,患者移植后1个月的HBB、KLF1及BCL11A的表达均较其他时间点的显著增高,而移植后1个月的HBG表达则较其他时间点的降低。 2、免疫磁珠法分选到高纯度的骨髓CD34+细胞,二阶段无血清培养体系可获得高扩增率、高比例的终末期红细胞,在定向分化过程中,红细胞特异性相关基因的表达符合正常生理过程。 3、全基因组DNA甲基化谱显示,CG环境下的DNA甲基化发生频率和甲基化水平占绝大部分;对不同基因功能区的DNA甲基化水平进行比较,外显子区和内含子区的甲基化水平最高,转录起始位点(transcription start site,TSS)附近的基因体区域达到最低值,而供者所有基因功能区域的甲基化水平均高于患者移植前及移植后的。鉴定了重型β-地中海贫血患者与移植后及健康供者之间的DMRs,它们捕获了许多与造血分化以及红系分化相关的转录差异,尤其是在转录启动子结合区。最后,我们还对患者疾病状态与移植后状态或健康供者之间的DMR相关基因做了GO富集分析,结果显示,有丝分裂细胞周期调控、细胞生长和分裂调控、细胞凋亡调节、蛋白质定位维持、蛋白质分泌调节、基因表达调控、组蛋白H2A乙酰化等生物过程显著富集。 4、我们通过细胞周期和对不同阶段细胞的DEGs进行GO富集分析,发现early-Ortho E这一阶段细胞仍能进行红细胞分化,这与以往的研究结果有所不同;在患者移植前样本中,我们在Ortho E阶段的GO富集中还发现了参与红细胞稳态负向调节的生物过程。对不同组别样本进行终末期红细胞基因表达动态变化差异分析,发现IFI27、MGST3和HEMGN,在移植前组vs移植后1个月组以及移植前组vs供者组均具有差异表达。在DMGs和DEGs联合分析中,与移植后1个月组相比,移植前组CST3、USP34、CD164、TNRC6B、ELF1和CD44在低甲基化的情况下上调。 结论:本研究通过全基因组甲基化测序及单细胞转录组测序技术,构建了重型β-地中海贫血患者终末期红细胞分化相关的差异甲基化图谱,并捕获了许多与造血分化以及红系分化相关的转录差异,尤其是在转录启动子结合区。筛选出与地中海贫血红系细胞发育分化相关的DEGs:IFI27、MGST3和HEMGN,以及DMGs:CST3、USP34、CD164、TNRC6B、ELF1和CD44。这些差异甲基化基因及转录组基因可为研究β-地中海贫血疾病红细胞分化进程的分子机制提供基因靶点。