关键词：
磁性纳米材料
量子点
细菌耐药
pH响应
二维纳米片
电化学发光
摘要：
细菌耐药是目前全球公共卫生领域最复杂的威胁之一。耐药菌感染问题日益突出,可导致病人住院时间延长、治疗费用增加以及病死率升高等问题。耐药菌的检测对于感染性疾病诊断、用药指导、疗效监测以及感染控制都具有极其重要的意义。然而,临床上传统的耐药菌检测方法,如药敏试验通常需要一个较长的周期用于细菌体外扩大培养,检测的时效性不符合临床预期;PCR技术主要用于耐药基因检测,但需要特定的仪器及专业操作人员,且不能检测未知的耐药基因,仍不能很好满足临床诊疗的需要。为此,探索简单、快速、灵敏和特异的检测方法已成为临床耐药菌感染诊疗的迫切需求。磁性纳米材料是一类具有磁性材料的超顺磁性、磁导向性等特点,又兼具纳米材料制备工艺简单、生物兼容性好和表面活性强等优势的纳米材料,能够为复杂基质中细菌的富集分离和临床样本中低丰度的细菌的直接检测提供有力的技术支持。另一方面,量子点作为一种新型的发光材料,具有光稳定性好、可多色标记以及生物相容性好等优点,尤其镉基量子点在电化学发光领域表现出巨大的应用潜力。因此,本研究主要基于万古霉素修饰的Fe3O4@Au纳米磁珠和锌掺杂硫化镉量子点,结合高灵敏、特异、操作简便、快速的电化学传感或电化学发光（ECL）平台,建立了一系列简单、快速的生物传感检测新方法,实现了对两种常见多重耐药菌的检测,为临床多重耐药菌感染的精准诊断提供了潜在的技术平台,具有良好的临床应用前景。研究内容主要分为以下两个部分:1. 基于万古霉素修饰的Fe3O4@Au磁富集和碳青霉烯酶水解反应用于多重耐药菌的快速检测耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（CRE）是目前最引人关注的多重耐药菌之一。实现CRE的快速简便检测在控制该类细菌所致感染以及防止细菌的播散方面具有重要意义。首先,水热法一步合成Fe3O4纳米粒子,通过表面APTS改性进一步合成Fe3O4@Au纳米粒子,再利用万古霉素对其进行表面修饰。由于万古霉素分子可特异性结合细菌细胞壁肽聚糖骨架成分D-Ala-D-Ala多肽,所合成的万古霉素修饰的Fe3O4@Au纳米粒子可以有效的从尿液标本中富集和分离CRE。其次,对分离得到的CRE进行超声裂解,充分释放细菌内的碳青霉烯酶,该酶具有水解底物亚胺培南的特性,释放氢离子引起溶液p H降低。最后,该水解反应可通过p H响应被p H计所检测,通过测定溶液p H值即可检测尿液中CRE的浓度。该检测方法的线性范围是10～4～10～8 cfu?m L-1,最低检测限为10～3 cfu?m L-1,可在3.5小时内完成尿液标本中CRE的检测。该检测方法具有简单、实时、快速、无酶和稳定的优势,为耐药菌所致感染的临床诊断、治疗监测和预后评估提供了强有力的技术支持,为探索耐药菌快速检测新技术提供了新的思路。2. 基于Pd Mo双金属烯猝灭Zn Cd S量子点电化学发光免疫传感器用于多重耐药菌的快速检测基于锌掺杂硫化镉（Zn Cd S）量子点作为强效稳定的电化学发光物质,S2O82-溶液作为共反应剂,结合功能化的Pd Mo双金属烯作为猝灭剂,构建了一种高灵敏的“开关”式ECL免疫传感器,用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）检测。在本研究中,修饰在金电极（GE）上Zn Cd S量子点,可在S2O82-溶液中产生稳定的ECL信号,使ECL信号达到“开”的状态。通过抗原抗体反应,MRSA分别结合Pd Mo-anti-SA和修饰在Zn Cd S量子点上anti-PBP2a,形成类似于双抗体夹心的“三明治”结构。其中,片层材料Pd Mo-anti-SA可通过接收S2O82-产生的电子,从而阻碍Zn Cd S激发态的形成,发挥猝灭作用,使ECL信号处于“关”的状态。通过检测ECL信号“开-关”的变化,可以实现对MRSA的定量检测。结果显示ECL信号强度与MRSA浓度在1.5×10～2～1.5×10～8 cfu·m L-1范围内的对数呈线性关系,该方法的最低检测限为22 cfu·m L-1。此外,本方法可用于尿液样本中MRSA的检测,展现良好的特异性、重复性及稳定性。因此,该方法有望成为临床早期诊断耐药细菌感染的潜在应用手段。综上,本研究所建立的一系列多重耐药菌的检测新方法具有操作简便,成本低廉,耗时短等优点,同时也具备良好的分析性能,弥补了传统分析方法的不足,为耐药菌所致感染的临床诊断、用药指导、治疗监测和预后评估提供了潜在的技术平台,为探索耐药菌快速检测新技术提供了新的研究思路。
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