关键词： 脊髓灰质炎病毒   类病毒颗粒   杆状病毒   昆虫细胞  

摘要： 脊髓灰质炎病毒(PV)是一种可以感染中枢神经系统,引起脊髓灰质炎疾病的人类肠道病毒。很早已有PV灭活疫苗和口服脊灰减毒活疫苗来预防脊髓灰质炎的发生。尽管随着两种疫苗的问世,很大程度上减少了疾病的发生,但是还是存在一定安全隐患。病毒样颗粒(VLPs)在结构上类似于天然病毒颗粒但不包含感染性病毒核酸但可以重保留原有的抗原表位,能够诱导机体产生特异性免疫应答并发挥保护作用。因此制备类病毒颗粒脊髓灰质炎疫苗成为了当下研究热点。杆状病毒表达系统是一种安全高效的真核表达系统,具有对外源蛋白加工修饰的功能,且容纳外源基因的空间大,能同时表达多种蛋白,且只感染昆虫细胞,安全性更高,是一种理想的真核表达载体。因此本实验选用昆虫-杆状病毒表达系统对2型脊髓灰质炎类病毒颗粒进行了一系列表达研究。研究内容如下。脊髓灰质炎毒的主要蛋白由P1基因编码,可被3CD蛋白酶裂解成病毒结构蛋白VP1、VP3和VP0。这些病毒结构蛋白可以自组装形成病毒的衣壳蛋白,本实验据此原理,设计构建了野生型转移载体p Bac-3CD-P1,将可编码sabin株II型P1基因和具有裂解蛋白活性的3CD基因整合到p Bac PAK8载体中,通过转移载体将目的基因以同源重组的形式整合到杆状病毒基因组中,制备重组杆状病毒感染昆虫细胞来实现异源共表达P1和3CD蛋白,并能自组装成VLP。通过western-blot和D抗原含量测定对表达水平进行验证了目的蛋白的表达,在此基础上,尝试对P1基因进行稳定性突变,设计构建了突变型转移载体p Bac-3CD-P1/5和p Bac-3CD-P1/2,以同样的方法制备了重组杆状病毒(r Bac-3CD-P1/5和r Bac-3CD-P1/2),在感染细胞后,发现SN2/5类病毒颗粒的表达水平反而降低了,SN2/2类病毒颗粒的表达水平有所提高。表明只保留两个关键位点对P1基因进行组合突变的方案是有效的。尝试对重组类病毒颗粒的纯化工艺进行了初步优化探索,在对目的蛋白的快速提取捕获阶段,分析比较了两种疏水层析填料(butyl和phenyl),和一种阳离子交换层析填料(Nano Gel50 SP)对类病毒颗粒的捕获效果,通过样品前处理的回收率、单位体积填料的上样量,目的蛋白的洗脱情况进行分析比较,确定了离子交换层析对类病毒颗粒的捕获效果最佳。之后又对中间纯化和精细纯化过程进行优化,对最终纯化的蛋白样品进行SDS-PAGE验证后,发现类病毒颗粒经Nano Gel50 SP捕获,phenyl和Core400精细纯化后,样品条带比较干净,纯化效果最好。在透射电镜下观察到了颗粒均一分明的直径约30nm的球形颗粒,结果表明重组杆状病毒感染昆虫细胞后,表达的P1蛋白可以被有效切割成VP0、VP1和VP3结构蛋白,且能自组装成类病毒颗粒。对SN2/2重组类病毒颗粒样品和SN2/0重组类病毒颗粒样品在4℃和37℃储存条件的稳定性进行了初步研究,发现突变型SN2/2重组类病毒颗粒样品的稳定性更高。利用高分辨质谱法分别从完整蛋白水平和肽图谱水平对各型VP0、VP1、VP3进行结构表征。在完整蛋白水平上对表达的三种结构蛋白VP0、VP1、VP3进行精确分子量分析,各组分理论分子量和检测分子量均一致。利用胰蛋白酶酶解溶液和胶内蛋白质,对各型VP0、VP1、VP3进行肽图谱分析,结果显示序列覆盖率均较高,N端测序与理论序列一致,同时N端发生肉豆蔻酰化修饰,与预测理论信息一致。免疫结果表明昆虫细胞制备的重组2型类病毒颗粒具有良好的免疫原性;尽管由于包被抗原的差异导致三个剂量组的总抗体滴度低于阳性对照组;但中和滴度测定结果表明重组2型类病毒颗粒能有效刺激产生中和抗体,且达到中、高接种剂量时,一免中和滴度高于阳性对照,表明开发PV-VLP疫苗具有可行性。

关键词： 多态性   单核苷酸   低相对分子量蛋白酶体基因   抗原加工相关转运体基因   内质网氨肽酶基因   脊髓灰质炎疫苗  

摘要： 目的:宿主遗传因素对疫苗诱导的抗体应答的影响是新兴疫苗基因组学研究的重要方向。本研究拟通过对MHC I类抗原提呈通路基因:低分子质量蛋白酶体(Low molecular weight proteasome,LMP)、抗原加工相关转运体(Transporter associated with antigen processing,TAP)和内质网氨肽酶(Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase,ERAP)3 个基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)与脊髓灰质炎疫苗序贯免疫接种后诱导的脊灰抗体应答进行关联分析,初步探索MHC Ⅰ类抗原提呈通路基因对脊灰疫苗抗体应答的可能影响。方法:选取广西壮族自治区357名2-3月龄接种2剂灭活脊髓灰质炎疫苗(Inactivated polio vaccine,IPV)和 1 剂二价口 服脊髓灰质炎疫苗(Oral polio vaccine,bOPV)的受试者,检测免前和基础免疫后28天血清中三种型别的脊灰病毒中和抗体水平。采用 TaqMan 探针基因分型法对 LMP2 基因 rs17587(G>A),LMP7 基因 rs2071543(G>T)、TAP1 基因 rs41549617(G>A)、rs1057141(C>T)、rs1135216(T>C)、rs1057149(C>T),TAP2 基因 rs1042116(G>A)、s2228396(C>T)、rs4148876(G>A),ERAP1 基因rs27037(G>T)、rs27044(C>G)、rs30187(C>T)、rs26618(T>C)、rs26653(C>G)、rs3734016(C>T),ERAP2基因 rs2549782(T>G)、rs2548538(A>T)、rs2248374(G>A)、rs2287988(A>G)、rs1056893(T>C)位点进行基因分型,计算各SNPs位点的等位基因和基因型频率,分析SNPs与脊灰抗体应答的相关性。结果:(1)LMP2 基因 rs17587、LMP7 基因 rs2071543、TAP1 基因 4 个 SNPs、TAP2基因3个SNPs的各等位基因、基因型携带者,在脊灰疫苗诱导的3个型别的中和抗体GMT水平均未显示差异;不同TAP1和TAP2等位基因型携带者也未显示GMT水平差异。(2)携带ERAP1基因rs3734016-C等位基因个体的Ⅰ、Ⅱ型脊灰病毒中和抗体GMT低于携带T等位基因个体(11.914±0.074 vs 12.375±0.166,P=0.024;6.093±0.072 vs 6.548±0.188,P=0.025)。ERAP2基因 rs2549782、rs2548538、rs2248374、rs2287988、rs1056893各基因型携带者间Ⅰ型脊灰病毒中和抗体GMT水平存在差异(均为 11.925±0.223 vs 11.741±0.141 vs 12.378±0.157,P=0.016)。但以上结果经Bonferroni校正后均无统计学差异。(3)LMP、TAP、ERAP各SNPs未显示单独或协同作用与脊灰Ⅱ型抗体阳转的相关性(P>0.05)。结论:LMP、TAP、ERAP基因多态性与脊灰疫苗免疫后抗体应答未显示显著相关,可能不是影响脊灰疫苗诱导的抗体应答的主要遗传因素。

关键词： 疫苗转换后   脊灰病毒   流行情况   病毒变异特征  

摘要： 目的:通过人群和外环境监测,阐明2016年5月脊髓灰质炎(脊灰)疫苗免疫策略改变后福建省脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV)的流行株变化特征,评估新免疫策略是否完全阻断2型脊灰病毒(PV2),为我省维持“无脊灰”状态及在消灭脊灰后期阶段制定相关免疫策略提供一定的理论依据。方法:在急性弛缓性麻痹病例(Acute Flccid Paralysis,AFP)常规监测基础上,增加健康儿童和环境污水监测。对人群中采集的粪便标本及外环境污水标本进行病毒分离与鉴定,将病毒分离株进行全基因组扩增并测序。应用Excel 2007对监测数据进行汇总、整理,并利用SPSS 19.0对脊灰病毒分布特征进行分析。利用Bio Edit 7.***.9.0、Sequencher 4.1.4对测得的脊灰病毒序列进行拼接、比对,应用MEGA X＿10.2.4、Simplot 3.5.1等生物信息软件对脊灰病毒VP1区基因特征和全基因组序列进行分析,计算脊灰病毒与Sabin疫苗株的核苷酸序列差异性,并分析减毒位点、抗原位点变异及重组等情况。结果:1.福建省AFP监测系统始终维持着高敏感性及高及时性,报告病例分布在疫苗转换前后,9个地市间存在差异,但均达到各要求指标;在年龄组分布中,疫苗转换前以<3岁小年龄组为主,疫苗转换后以3～14岁AFP病例数增多;性别构成比及免疫史等分布均无差异。3956份AFP病例及密切接触者粪便标本中PV分离阳性数62株(1.6%),疫苗转换前后分离率分别为1.9%(38/1986)和1.2%(24/1970),两者差别无统计学意义。疫苗转换后不同阶段开展健康儿童带毒率调查,PV分离率为2.3%(27/1161)。2013～2020年环境污水监测标本中PV阳性率为43.1%(196/455),疫苗转换前后分别为27.5%(39/142)和50.2%(157/313),转换后明显高于转换前。提示污水中脊灰病毒分离率最高。2.三个不同来源监测到的脊灰病毒株共516株,其中AFP病例62株,健康儿童27株,污水427株,经鉴定均为疫苗相关脊灰病毒(Vaccine-associated Poliovirus,VAPV)。疫苗转换前于AFP病例分离到的38株PV中6株PV1,13株PV2,19株PV3;除3株PV1和1株PV3为高变异株外,其余34株PV的VP1区核苷酸变异数均<6个;疫苗转换后AFP病例分离到的24株PV中7株PV1,17株PV3;其中5株3型疫苗衍生脊灰病毒(Vaccine-derived Poliovirus,VDPV),其余19株VP1区核苷酸变异数均<6个。健康儿童中分离到27株PV,均为PV3型,变异数均<5个,涉及17个位点。污水中分离到427株PV,均为脊灰疫苗株病毒;疫苗转换前74株中,分别为5株PV1,49株PV2,20株PV3;疫苗转换后353株中,56株PV1,297株PV3;疫苗转换前后共61株PV1的VP1区核苷酸变异数均<5个;PV3在疫苗转换前监测到1株高变异株和1株重组株,转换后监测到1株高变异株和1株VDPV,其余变异均<5个,且大部分变异<2个。可见疫苗转换后,福建省未再监测到PV2型病毒,提示PV2型疫苗株已被阻断。疫苗转换后PV3型成为了绝对优势血清型,发现的高变异株和VDPV也均为PV3型。3.46株代表性毒株全基因组序列分析显示,16株PV1代表株中,疫苗转换前代表株与Sabin1疫苗株的核苷酸序列平均差异性(0.47%)大于疫苗转换后(0.11%);30株PV3代表株中,疫苗转换前代表株与Sabin3疫苗株的平均差异性(3.43%)较疫苗转换后(4.00%)无差别。3株PV1(3/16,18.6%)及23株PV3(23/30,76.7%)发生重组,无论PV1还是PV3,疫苗转换前的共12重组株中10株(83.3%)与PV2型重组;而疫苗转换后,所有14株重组株均未发现与PV2的重组,再次证实,福建省内已经阻断了PV2型循环。16株PV1代表株中共有4例(62.5%,4/7例AFP)残留麻痹病例,其分离株(5株)均出现1～3个减毒位点回复突变,而无减毒位点回复突变的其他3例均无残留麻痹,提示减毒位点的回复突变可能和病例严重程度关系密切。30株PV3代表株中共有10例(52.6%,10/19例AFP)残留麻痹病例,其分离株(10株)均发生1～4个回复突变,但无残留麻痹的P19-120-2病例分离株也有1个减毒位点回复突变;且所有残留麻痹病例分离株中均发生两种以上变异(重组、减毒位点回复突变、抗原位点变异),可见单一减毒位点的突变可能还不足以使其致残,尚需其他因素共同作用。结论:1.疫苗转换前后,PV在人群及环境中的分离率没有发生变化,疫苗转换对PV的分布没有造成影响。2.疫苗转换前P

关键词： 脊髓灰质炎病毒疫苗   肠道病毒   环境监测   系统发生   遗传进化  

摘要： [背景]肠道病毒(Enteroviruses,EVs)为单股正链RNA病毒,是小RNA病毒目(Picornavirales)小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属的成员。最初根据EVs在人体和动物实验中的致病性,将其分为脊髓灰质炎病毒(Polioviruses,PVs)、柯萨奇病毒A组、柯萨奇病毒B组、埃可病毒及EV-D68、EV-A71等新型EV。现基于EV VP1区序列的分子生物学定型方法将肠道病毒属分为15组:肠道病毒 A 组(Enterovirus A,EV-A)到 L 组(Enterovirus L,EV-L)、鼻病毒 A组(Rhinovirus A,RV-A)到 C组(Rhinovirus C,RV-C),其中人类 EV各血清型为EV-A～EV-D共4个组。PV感染所引起的脊髓灰质炎(脊灰)曾导致我国数以万计的儿童残疾和死亡,其同时也是典型的疫苗可预防性疾病。自我国实施儿童计划免疫以来,一直实行4剂次三价脊灰口服减毒活疫苗(Trivalent Oral Polio Vaccine,tOPV)免疫程序。在全球消灭脊灰行动的最后阶段,为了降低疫苗相关麻痹型脊灰病例(Vaccine-associated Paralytic Poliomyelitis,VAPP)的发生率和疫苗衍生脊灰病毒(Vaccine-derived Poliovirus,VDPV)的流行风险,同时继续维持我国无脊灰状态,我国在2016年5月根据WHO全球的统一要求调整了脊灰免疫策略,在免疫程序中首剂次引入脊髓灰质炎灭活疫苗(Inactivated Polio Vaccine,IPV),后续剂次使用去掉原来tOPV中的Sabin Ⅱ型的双价脊灰口服减毒活疫苗(Bivalent OPV,bOPV)。目前我国为维持无脊灰状态开展了两种监测工作。全国范围开展的急性弛缓性麻痹(Acute Flaccid Paralysis,AFP)病例监测是我国为及时发现输入性PV野病毒和VDPV及其循环所采取的针对15岁以下人群AFP症状的监测,自1994年建立以来在我国已持续运转数十年。除了探测到PV之外,AFP监测还可以检测到多种非脊灰肠道病毒(Non-polio Enterovirus,NPEV),是我国在没有专门的EV监测系统的条件下探索NPEV循环的有力手段。环境监测(Environmental Surveillance,ES)是WHO推荐的作为AFP监测系统的补充手段,国内仅在山东省等少数省份开展,其对本地循环的PVs及NPEV检出的敏感性已经在全球多个国家和地区得到证实。我国引入脊灰疫苗新策略将会引起人群中疫苗株PV流行情况的改变,导致产生一系列理论和实际工作中的科学问题。通过ES的方法探索脊灰免疫策略调整后人群中脊灰病毒传播流行的动态变化,有助于提高我们对脊灰病毒在人群中流行的认识,为预警VDPV乃至cVDPV的发生提供依据。同时,开展NPEV的持续性环境污水监测研究,有助于阐明NPEV的循环变化特征及其与临床病例分离株之间的关联,极大丰富NPEV分子流行病学数据,为控制相关疾病的暴发流行提供科学依据。[研究目的]1.分析山东省2015～2018年在我国脊灰免疫策略改变前后环境监测及AFP病例监测系统中脊灰病毒的型别构成动态变化和基因特征。2.分析山东省2015～2018年NPEVs的流行状况,探索其时间循环模式和优势型别的变迁。3.探究NPEV优势流行型别的遗传进化特征。[研究方法]1.标本采集:2015～2018年,在济南、临沂、烟台3个市的城区各选择一处污水处理厂,在污水入口处按月采集污水标本,使用阴离子膜吸附洗脱法进行EV浓缩;同期,开展AFP病例监测,按照《全国急性弛缓性麻痹(AFP)病例监测方案》要求采集并处理AFP病例粪便标本。2.病毒分离:将污水浓缩液和AFP大便悬液接种至RD、Hep-2、L20B细胞进行EV分离,盲传二代,收获冻存EV分离株。***1编码区RT-PCR扩增:提取EV病毒株RNA,使用一步法RT-PCR试剂盒进行EV VP1完整编码区的扩增,PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。4.基因测序和定型:对PCR阳性产物进行双向Sanger测序,测序结果经拼接整理后,按照EV分子定型方法进行型别鉴定。5.序列分析:对获得的EVVP1完整编码区序列,使用BioEdit(v7.***.9.0)软件进行序列筛选和多序列比对;使用MEGA(v.7.0)软件基于邻位法构建系统发生树;使用BEAST(v.1.10.4)软件对NPEV优势型别毒株进行遗传进化分析,了解其平均进化速率及最近共同祖先,构建最大可信树。6.统计学分析:采用SPSS 27.0软件对流行病学数据进行统计分析,采用卡方检验(χ2)进行率或构成比的检验,P<0

关键词： 脊髓灰质炎灭活疫苗   疑似预防接种异常反应   监测  

摘要： 目的评价脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)纳入国家免疫规划后的疑似预防接种异常反应(AEFI)发生率。方法通过全国AEFI监测信息管理系统,收集江西省2016-2019年适龄儿童常规接种Salk株IPV(IPV-Salk)和Sabin株IPV(IPV-Sabin)后的AEFI个案,采用描述性方法分析AEFI报告发生率。结果江西省2016-2019年共报告IPV AEFI 330例,发生率为17.91/10万剂,其中IPV-Salk、IPV-Sabin分别为19.12/10万剂、17.03/10万剂。IPV一般反应报告发生率为15.14/10万剂,其中IPV-Salk、IPV-Sabin分别为16.41/10万剂、14.22/10万剂;IPV异常反应报告发生率为2.22/10万剂,其中IPV-Salk、IPV-Sabin分别为2.07/10万剂、2.34/10万剂。结论江西省IPV AEFI发生率在可接受范围内,IPV-Salk与IPV-Sabin AEFI发生率相当。

关键词： 脊髓灰质炎疫苗   氢氧化铝佐剂   脊髓灰质炎灭活疫苗   供应缺口   免疫原性   脊灰灭活疫苗   灭活病毒   IPV  

摘要： IPV-AI是将灭活病毒吸附到氢氧化铝佐剂上而获得的脊髓灰质炎灭活疫苗,该疫苗可节省灭活病毒的剂量有利于缓解IPV的全球供应缺口和成本的问题。这项试验的目的是证明IPV-AI与标准IPV相比毫不逊色。该试验分别在菲律宾的5个地点进行。研究者对未接种过任何脊髓灰质炎疫苗的婴儿分别在其6、10、14周龄时随机注射3次IPV-AI(n=502)或IPV(n=500),并在9月龄时接种一次加强针。

关键词： 生活污水   脊灰病毒   环境监测  

摘要： 目的通过对2018年江西省污水处理厂生活污水中脊髓灰质炎病毒(脊灰病毒,PV)的持续监测,为维持无脊灰状态提供实验室环境监测数据支持,将预防工作关口前移。方法选择青山湖区污水处理厂作为长期固定监测点,每月在污水处理厂入水口采集1L污水作为样本。膜浓缩后在L20B、RD、Hep-2三种细胞上培养,鉴定1型、2型、3型脊灰病毒。结果采集生活污水样本12份,共10个月分离出脊灰病毒23株,分离率为83.33%,分别为PV 1型2株(8.7%),PV 3型21株(91.3%)。有1株PV1(JX2018JHH024R)在突变热点nt2749处发生(A->G)的突变,导致甲硫氨酸(Met)替代了异亮氨酸(Ile),有2株PV3(JX2018JHH095L、JX2018JHH097L)在nt2636处发生了(G->A)的变异,导致了极性氨基酸替代了疏水氨基酸。结论PV 3型为江西省生活污水中的PV优势株。未在环境监测中发现脊灰野病毒、脊灰病毒疫苗衍生株及PV2株。分离出的PV1和PV3株有部分位点发生突变,需持续监测。

关键词： 脊髓灰质炎疫苗   轮状病毒疫苗   甲肝疫苗   狂犬病疫苗   疫苗安全性   风疹   免疫反应   水痘  

摘要： 新冠疫苗即将问世,然而仍有少数人对疫苗安全性持怀疑态度。为让大众全面认识疫苗,美国《预防》杂志最新总结了有关疫苗研制方法、作用过程及救命机理等10个真相。1.疫苗借助少量病毒建立免疫。疫苗可有针对性地将“已死亡病菌”或“已削弱到无法伤害人体的病菌”注入人体,进而建立抗体库,达到免疫目的。如脊髓灰质炎疫苗、甲肝疫苗、狂犬病疫苗都由死亡病毒制成,MMR(麻疹、腮腺炎、风疹)、水痘和轮状病毒疫苗中则含有弱病毒,这些弱病毒不会致病,但足以产生免疫反应。

关键词： 柯萨奇A组病毒   急性弛缓性麻痹   手足口病  

摘要： 目的对2015—2019年河南省急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)病例中,在转人类脊髓灰质炎病毒受体小鼠肺细胞(mouse cell line expressing the gene for human cellular receptor for poliovirus,L20B)增殖的非脊髓灰质炎肠道病毒基因定型和序列特征分析。方法利用VP4-VP2编码区引物EVP4和OL68-1进行肠道病毒鉴定,均为柯萨奇A组病毒(coxsackievirus A,CV-A),分别为CV-A4、CV-A8和CV-A10。在利用CV-A4、CV-A8和CV-A10 VP1区特异性引物进行VP1区序列扩增和亲缘进化树构建。结果9例L20B阳性分离物中,1例为CV-A4,1例为CV-A8,7例为CV-A10。通过亲缘进化树构建,CV-A4属于D基因型,CV-A8属于B基因型,CV-A10属于E基因型。结论河南省L20B细胞增殖的非脊髓灰质炎肠道病毒为CV-A4、CV-A8和CV-A10,通过这些病毒基因特征分析对手足口病和AFP预防控制具有重要意义。