关键词:
低氧预处理
条件培养基
细胞间缝隙连接通讯
缝隙连接蛋白43
基质金属蛋白酶-2
摘要:
背景 再灌注心律失常(reperfusion arrhythmia,RA)是体外循环心内直视手术中心肌缺血再灌注损伤较为常见的并发症,探索其发生机制对预防RA有重要意义。目的 研究低氧预处理H9C2细胞条件培养基对低温缺氧-复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)心肌细胞的保护作用,为预防和减少RA的发生提供实验支持。方法 将H9C2细胞随机分为5组,分别为阴性对照组(C组,以等体积含10%胎牛血清的DMEM培养基培养正常心肌细胞)、低氧组(H组,低氧条件培养基培养低温H/R心肌细胞)、常氧组(N组,常氧条件培养基培养低温H/R心肌细胞)、重组蛋白基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)组(MMP-2组,200 ng/mL重组蛋白MMP-2培养基培养低温H/R心肌细胞)和MMP-2抑制剂组(ARP-100组,0.03 mol/L ARP-100培养基培养低温H/R心肌细胞)。CCK-8法检测心肌细胞活力;Hoechst33342染色及流式细胞术Annexin V/PI双染检测心肌细胞凋亡率;划痕标记染料示踪技术检测缝隙连接通讯;明胶酶谱法检测细胞培养液中MMP-2活性;Western blot检测MMP-2、缝隙连接蛋白43 (connexin 43,Cx43)和磷酸化Cx43 (p-Cx43)蛋白表达;免疫荧光检测心肌细胞膜上Cx43表达。结果 与C组相比,N组心肌细胞活力降低(P<0.01),凋亡增加(P<0.01),缝隙连接通讯减弱,MMP-2表达上调(P<0.01),Cx43和p-Cx43表达均下调(P<0.01),心肌细胞膜上Cx43荧光强度减弱(P<0.05)。与N组相比,H组心肌细胞活力升高(P<0.01),凋亡减少(P<0.01),缝隙连接通讯增强,MMP-2活性降低(P<0.05),MMP-2表达下调(P<0.01),Cx43和p-Cx43表达均上调(P<0.01),心肌细胞膜上Cx43荧光强度增强(P<0.05)。与MMP-2组相比,H组和ARP-100组心肌细胞Cx43及p-Cx43表达均上调(P<0.01),心肌细胞膜上Cx43荧光强度增强(P<0.01),缝隙连接通讯增强。结论 低氧预处理H9C2细胞条件培养基通过抑制MMP-2活性介导上调Cx43和p-Cx43表达,从而改善低温H/R心肌细胞间缝隙连接通讯,减少心肌细胞凋亡,提高心肌细胞活性。